在渝流通双黄连口服液质量分析

余 为

（重庆市黔江食品药品检验所，重庆 409000）

双黄连口服液由金银花（双花）、黄芩、连翘经现代工艺加工制成，具有疏风解表、清热解毒等功效，主要用于治疗外感风热所致感冒、甲型H1N1流感、重症急性呼吸综合征、流行性腮腺炎、口腔溃疡等［1－5］。2020年起，双黄连因被发现口服后可通过多靶点、多通路抑制新型冠状病毒［6－8］而热销。本研究中对35批在渝流通双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸、连翘苷3个指标性成分进行检测，以为临床应用提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

1260型高效液相色谱仪，含二极管阵列检测器（美国Agilent公司）；XP205型分析天平（美国Mettler Toledo公司，精度为0.01 mg）；SB－800DT型超声波清洗仪（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2 试药

黄芩苷对照品（批号为110715－201318，含量为93.3%），绿原酸对照品（批号为110753－201415，含量为96.2%），连翘苷对照品（批号为110821－201615，含量为94.9%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯；冰醋酸、中性氧化铝均为分析纯；水为超纯水。35批双黄连口服液（见表1）均为2017年起就在重庆流通且送监督抽检的产品，被抽检单位主要来自重庆辖区的医院、诊所、药品批发公司、连锁药店、个体药店等。

表1 35份双黄连口服液样品信息Tabl.1 Information of 35 samples of Shuanghuanglian Oral Liquid

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SR－C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：黄芩为甲醇－水－冰醋酸（50∶50∶1，V/V/V），金银花为甲醇－水－冰醋酸（20∶80∶1，V/V/V），连翘为乙腈－水（25∶75，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：黄芩为274 nm，金银花为324 nm，连翘为278nm；柱温：25℃；进样量：黄芩为5μL，金银花、连翘均为10μL。

2.1.2 溶液制备

黄芩：取黄芩苷对照品适量，精密称定，用50%甲醇溶解，制成质量浓度为0.1 mg/mL的黄芩苷对照品溶液。精密量取样品1 mL，置50 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释，超声（功率800 W，频率40 kHz）处理20 min，放至室温，用50%甲醇定容，即得黄芩供试品溶液。按双黄连口服液工艺及处方制备缺黄芩的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

金银花：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色容量瓶中，加水溶解，制成质量浓度为40μg/mL的绿原酸对照品溶液。精密量取样品2 mL，置50 mL棕色容量瓶中，加水定容，摇匀，即得金银花供试品溶液。按双黄连口服液工艺及处方制备缺金银花的阴性样品，并按供试品制备方法制备阴性对照品溶液。

连翘：取连翘苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇，制成质量浓度为60μg/mL的连翘苷对照品溶液。精密量取样品1 mL，过中性氧化铝柱（100～120目，6 g，内径为1 cm），用70%乙醇40 mL洗脱，然后浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解后转移至5 mL容量瓶中，再用50%甲醇定容，摇匀，即得连翘供试品溶液。按双黄连口服液工艺及处方制备缺连翘的阴性样品，并按供试品制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：分别取2.1.2项下3种对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果各测定组分能与相邻组分完全分离，理论板数均大于5 000。色谱图见图1。

1.黄芩苷 2.绿原酸 3.连翘苷A，D，G.对照品溶液（分别为黄芩苷、绿原酸、连翘苷） B，E，H.供试品溶液C，F，I.阴性对照品溶液（分别缺黄芩、金银花、连翘）图1 高效液相色谱图1.baicalin 2.chlorogenic acid 3.forsythinA.D，G.Reference solution（baicalin，chlorogenic acid and forsythin respectively）B.E，H.Test solution C.F，I.Negative reference solution（without Scutellariae Radix，Lonicerae Japonicae Flos and Forsythiae Fructus respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.1.2项下3种对照品溶液各2，5，10，15，20μL，按2.1.1项下色谱条件进样测定，以各对照品溶液质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，黄芩苷为Y1＝6.033 4X1＋56.51，r＝0.999 1（n＝5）；绿原酸为Y2＝35.095X2－120.83，r＝0.999 5（n＝5）；连翘苷为Y3＝5.882 6X3＋42.476，r＝0.999 8（n＝5）。结果表明，黄芩苷、绿原酸、连翘苷质量浓度分别在40.77～407.68μg/mL、8.70～87.02μg/mL、12.65～126.48μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.1.2项下各对照品溶液适量，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果黄芩、金银花、连翘峰面积的RSD分别为0.35%，0.21%，0.40%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为16112611）适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，10，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果黄芩、金银花、连翘峰面积的RSD分别为0.93%，0.86%，1.02%（n＝6），表明供试品溶液室温下放置24 h内稳定。

重复性试验：取样品（批号为16112611）适量，共6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果黄芩、金银花、连翘含量的RSD分别为1.57%，1.33%，1.86%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为16112611），共6份，分别加入一定质量浓度对照品溶液，依法制备供试品溶液，并按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery test（n＝6）

2.1.4 样品含量测定

取35批样品各适量，依法制备供试品溶液，再按2.1.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表3。3个指标性成分的含量均高于2020年版《中国药典》标准，说明2017年起在渝流通双黄连口服液质量较好。产品内在质量差异较大，同一厂家、不同批号含量高低值相差也较大。详见表4。

表3 不同厂家样品指标性成分含量、相对密度及pH（n＝3）Tab.3 The content，relative density and pH of index components in the samples from different manufacturers（n＝3）

表4 相同厂家不同批号样品指标性成分含量、相对密度及pHTab.4 The content，relative density and pH of index components in different batches of samples from the same manufacturer

2.2 相对密度及pH

参照2020年版《中国药典（一部）》中方法检测，结果35份样品的相对密度为1.13～1.16，pH为5.30～6.19，均较稳定。详见表4。

2.3 样品聚类分析

采用SPSS 23.0统计学软件对35批样品进行聚类分析［9］，以各有效成分作为指标。结果可将样品聚为三类。其中，编号4，7，10－16，18－21，23，25，32，34样品聚为一类；编号1－3，5，9，17，24，26－30，33，35聚为一类；编号6，8，22，31聚为一类。详见图2。需注意，哈药集团三精制药股份有限公司及河南福森药业有限公司均有相同批号的2份样品分别聚在不同类，表明即使同一厂家相同批次的样品，内在质量依然存在较大差异。

图2 聚类分析结果Fig.2 Results of cluster analysis

3 讨论

程敏等［10］发现，山银花提取物伪品或掺伪品中绿原酸含量相对较高。2020年版《中国药典（一部）》规定绿原酸含量为0.60 mg/mL，35批样品中绿原酸含量最高达1.60 mg/mL，是否直接添加了某提取物有待考证，应考虑厂家是否按药品生产质量管理规范（GMP）要求生产，是否本着节约成本的原则核算金银花投料，可参照山银花特征图谱灰毡毛忍冬皂苷乙、指纹图谱进行考察［11］。研究表明，产地、采收季节及烘干方式均影响连翘苷的含量。如王琳等［12］等发现，连翘质量以河北产最优，其次为山西产，再次为河南产；青翘优于老翘；6月采收最优；采后汽蒸烘干处理较自然晾晒能更好地保存药用成分。刘廷等［13］采用超高效液相色谱串联质谱法测定双黄连口服液中6个酚酸类成分、3个苯乙醇苷类成分、8个黄酮类成分，故认为找出提取物特征图谱与原药材差异有利于从源头控制成药质量。

双黄连口服液临床应用较广，其功效的发挥与其内在质量紧密相关，绿原酸新批次含量几乎均高于旧批次，原因可能由于绿原酸为苯丙酸类，分子结构有酯键、不饱和双键及多元酚3个不稳定部分，在储存中易水解等异构化造成含量降低。查阅文献［14－15］可知，不同的纯化工艺、精制等环节的处理方法对绿原酸含量均有影响。为了提供质优、稳定的双黄连口服液，厂家需从黄芩、金银花、连翘的源头控制，严格执行GMP生产、流通环节的质量监管，以更好提高其品质。

综上所述，本研究中以黄芩苷、绿原酸、连翘苷的含量作为指标进行检测与分析，发现目前在渝流通双黄连口服液质量较好，但不同厂家、不同批号的双黄连口服液含量差异较大，需从药材源头、生产、流通等各环节对质量进行把控，以提高双黄连口服液质量的一致性。