蓝莓“绿宝石”组织培养和快速繁殖技术研究

毕海林，木永青，杨正松，董顺文，和志娇，阳 翠，苏泽春，和加卫*

(1.云南省农业科学院 高山经济植物研究所，云南 丽江 674199;2.丽江蓝玛生物科技开发有限责任公司，云南 丽江 674199;3.四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300)

蓝莓学名越桔，属于杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，为多年生落叶或常绿灌木。蓝莓果实含有丰富的花青素，具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、增强视力、抗癌等独特功效，国家粮农组织将其列为人类五大健康食品之一[1-2]。南高丛蓝莓品种“绿宝石”(Emerald)由美国佛罗里达大学于1999年选育成功，树体生长健壮，半开张，经过4年的生长后，树的高度可达1.5 m，树冠直径可达1.1 m。果实极大，蓝色，果蒂痕小且干，质地硬，果实口味甜中略有酸味，成熟期极早且较集中，产量高，适宜性强。

近几年，“绿宝石”在我国多地试种，表现十分良好，在我国南方地区成熟期早，尤其是云南低纬度高海拔地区在1月份就成熟，刚好是蓝莓鲜果市场的淡季，能极好地填补我国早熟蓝莓的市场，因此是发展潜力极大的早熟蓝莓品种。目前，我国蓝莓组织培养育苗技术已经成熟。毕海林[3]、和加卫[4]等对野生越桔进行了组织培养研究报道，前人等[5-10]对高丛蓝莓、兔眼蓝莓、矮丛蓝莓中的部分蓝莓栽培品种进行了组织培养技术的研究报道，但关于早熟蓝莓“绿宝石”组培快繁技术鲜见报道。笔者对蓝莓“绿宝石”进行了组织培养技术研究，摸索出了“绿宝石”的组培快繁技术，将有力地促进蓝莓“绿宝石”优质种苗的规模化生产，推动了我国早熟蓝莓的产业化发展。

1 材料与方法

1.1 材料

蓝莓栽培品种“绿宝石”枝条，取自云南省农业科学院高山经济植物研究所丽江新团蓝莓基地。

1.2 方法

1.2.1 外植体选取与初代培养

1.2.1.1 外植体选取 选择健壮且无病虫害的田间植株，分别在2月初取腋芽尚未萌发的2年生老枝条和4月下旬取当年生嫩枝条；选取大棚内有生长势的幼苗顶端茎段。

1.2.1.2 外植体消毒 将所取枝条剪成带1～2个腋芽或顶芽的茎段，先用洗衣粉液浸泡5 min，然后流水冲洗2 h，再放入超净工作台，先用70%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞溶液分别消毒10、6、4 min，无菌水浸洗5次后供接种用。

1.2.1.3 初代培养 将消毒后的3种外植体接种到启动培养基WPM+1.0 mg/L ZT上，培养基pH值为5.5。每瓶培养基接种1个茎段，以50个茎段为1个组合，分别重复3次。45 d以后统计其污染率、萌发率，并测量和计算萌发新枝条的平均长度(表1)。

1.2.2 继代增殖培养 将初代培养萌发的腋芽剪成约1 cm的茎段，接种到含不同激素的8种增殖培养基上，增殖培养基见表2，培养基pH值为5.5，每瓶接种10个茎段，以10个茎段为1个组合，分别重复3次，60 d后观测苗的生长情况，并计算其增殖系数。

将继代培养试管苗剪成1 cm的茎段，接种到同一种WPM培养基中，每瓶接种10个茎段，将培养温度分别设定为21、23、25、27、29 ℃，光强设定为2000 lx，培养基pH值为5.5，以10个茎段为1个组合，分别重复3次。60 d后观测苗的生长情况，并计算其增殖系数(表3)。

1.2.3 试管内生根培养及试管外扦插

1.2.3.1 试管内生根培养 将试管苗剪成约2 cm的茎段，接种到8种生根培养基中，生根培养基见表3。培养基pH值5.5，每瓶接种10苗，以10苗为1个组合，分别重复3次。观测记录各培养基中愈伤组织形成和生根时间，150 d后测量根长、根数、基部愈伤组织面积，并计算其生根率(表4)。

1.2.3.2 试管外扦插 将试管苗剪去基部愈伤组织，蘸1000 mg/L NAA后，分别扦插在填满4种基质的70孔穴盘中，4种基质见表5。扦插以后放入大棚内，大棚上方拉一层遮阳网，插好苗的穴盘上方扣上小拱棚，拱棚内温度控制在32 ℃以下，空气湿度保持在80%～95%，观测生根情况，以20苗为1个组合，分别重复3次，150 d后测量根数，并计算其生根率。

2 结果与分析

2.1 “绿宝石”不同生理年龄的外植体初代培养生长情况

由表1可以看出，刚入春的2月初腋芽尚未萌发的田间种植的“绿宝石”2年生老枝条茎段，用0.1%升汞溶液消毒10 min后，污染率还较高，说明老枝条带菌较多，较难消毒，并且没有污染的茎段萌发率也较低，多数腋芽萌发以后也不再伸长，一段时间后发现内部芽点变黑枯死，只有极少数萌发后开始缓慢地伸长。4月下旬取当年生嫩枝茎段，虽然消毒时间较短，但是外植体的污染率低，大部分腋芽萌发，且萌发以后基本上能生长成幼嫩枝条，萌发的新枝条平均长度接近3 cm；而大棚内有生长势的幼苗茎段，虽然消毒时间最短，但是外植体的污染率最低，绝大部分腋芽能萌发，并且基本上能生长成幼嫩枝条，萌发的新枝条平均长度达到3 cm。最重要的是，春季、夏季、秋季，大棚内的“绿宝石”幼苗，生长较旺盛，均可选取外植体，而且能结合幼苗的整形修剪，将剪下的幼苗顶端茎段，用作组培育苗的外植体材料，“绿宝石”幼苗经整形修剪后，能不断萌发出新的侧枝，可进一步将侧枝剪下作为外植体材料，以此源源不断地获得大量组培育苗的外植体材料。因此，蓝莓“绿宝石”组织培养，以大棚内幼苗顶端茎段为最佳外植体。

2.2 “绿宝石”在不同条件下的继代增殖情况

2.2.1 不同激素配比对“绿宝石”增殖的影响 由表2可以看出，培养60 d后，同时在培养基中添加细胞分裂素ZT和生长素NAA，苗基部均有较多淡绿色愈伤组织形成，绝大多数接种茎段形成单苗，丛生苗较少，增殖系数反而较低。相比较之下，较低水平的同浓度NAA伴随着ZT浓度的升高，苗基部的淡绿色愈伤组织呈逐渐变小的趋势，形成的丛生苗反而较多，增殖系数也相对较高。在只加细胞分裂素ZT的培养基中，苗基部形成愈伤组织不明显，仅仅稍微膨大，大多数接种茎段伸长的同时，基部均分化形成较多丛生苗，仅少数为单苗，增殖系数普遍较高；但是相比较之下，伴随着ZT浓度的增高，形成的丛生苗呈稍微减少的趋势，但苗稍微高一点，增殖系数略有降低。因此，在蓝莓“绿宝石”增殖培养过程中，较低浓度的玉米素ZT有利于“绿宝石”的增殖。

表2 “绿宝石”在不同激素配比条件下的增殖情况

2.2.2 不同温度对“绿宝石”增殖的影响 由表3可以看出，培养温度为21 ℃时，“绿宝石”的增殖系数为4.0，随着培养温度的升高，平均苗高逐渐增高，增殖系数也同时增加；29 ℃时苗最高，增殖系数达到最高，增殖系数为8.1。较高温度(29 ℃)的增殖系数是较低温度(21 ℃)的2倍左右。在本试验中，最低温和最高温培养中均没有出现玻璃化苗和畸形苗，苗生长均较健壮。由此可见，在一定温度范围内，高温有利于“绿宝石”的快速增殖。

表3 不同温度对“绿宝石”增殖的影响

2.3 “绿宝石”试管苗生根培养

2.3.1 不同生长素对“绿宝石”试管苗瓶内生根培养的影响 由表4可以看出，“绿宝石”在8种培养基中，随着苗的逐渐长高，苗基部均出现黄绿色愈伤组织，愈伤组织形成后，相当长的一段时间内基本没变化，约3个月后开始出现极少量的幼根分化。150 d后测量根数，并计算其生根率，结果发现：在8种培养基中，苗的生根率在60%～76%之间，没生根的苗基部愈伤组织部分少量变褐。同时添加IBA和NAA的培养基与仅添加IBA的培养基相比，后者苗基部的愈伤组织要小一些，相对应地，愈伤组织越小的培养基中苗的生根率稍高。由此说明，蓝莓“绿宝石”试管内诱导生根的时间极长，培养基中添加较低浓度的生长素时，苗基部形成的愈伤组织越小，生根时间稍短，生根率较高。说明在蓝莓“绿宝石”试管内生根诱导时，较高浓度的生长素诱导形成较大的愈伤组织，反而阻碍了其生根。当培养基中添加0.5 mg/L IBA时，生根率达到75.3%，是8种培养基中生根率最高的。因此，蓝莓“绿宝石”在WPM+0.5 mg/L IBA的培养基中生根率较高，但是生根时间他很长。

表4 不同生长素对“绿宝石”试管苗瓶内生根培养的影响

2.3.2 不同基质对“绿宝石”试管苗瓶外扦插生根的影响 由表5可以看出，“绿宝石”试管苗扦插在4种基质中的生根情况差异较大。以锯木屑+珍珠岩为基质的穴盘中，苗的生根情况较差，锯木屑中约3周后才出现少量短根，2个月时的生根率为67.2%；而以细沙+珍珠岩为基质的穴盘中的苗的生根情况最差，苗的基部很容易腐烂变黑，基部不变黑的苗需要1个月左右才生根，生根率较低。草炭土+珍珠岩、苔藓为基质的穴盘中苗的生根情况良好，15 d左右即出现无色的短根，一段时间后根变白，再逐渐变黄，2个月后统计观察发现，除了萎蔫的苗外，其余基本上均已长根，随着苗逐渐长高，顶部叶片也开始展开。由此可见，苔藓、草炭土+珍珠岩是“绿宝石”瓶外生根最好的扦插基质。

表5 “绿宝石”试管苗在4种基质中的生根情况

3 讨论与结论

组织培养已成为我国生产蓝莓优质种苗的一种主要方式。尽管其技术已经较为成熟，但越桔属不同野生种和不同蓝莓栽培品种的组培技术或多或少肯定存在一定的差异。蓝莓组培苗在试管内生根效果不佳，生根慢，生根率仅为30%～70%，因此主要采用试管外生根的方法[11]。

中国南北方气候差异大，应因地制宜，选择适合的时间，即气温回升但不太高时进行试管苗扦插。目前，生根扦插基质主要采用苔藓，一般在扦插半个月左右就开始生根，生根效果好，生根率高。本试验采用的2种生根基质，即苔藓和草炭土，其生根效果都很好。但比起苔藓来，以草炭土作为生根基质，根部土团容易散开，不方便运输，只宜就近上钵管理。而以苔藓为基质，生根以后，根与苔藓很好地缠绕形成不易散开的团块，方便长途运输，且保水性好。

本试验表明，蓝莓“绿宝石”组织培养以大棚内幼苗顶端茎段为最佳外植体。在增殖培养过程中，较低浓度的玉米素ZT有利于“绿宝石”的增殖。在一定温度范围内，高温有利于“绿宝石”的快速增殖；“绿宝石”在试管内需要很长的时间才能生根，在筛选出的较佳生根培养基1/2WPM+0.5 mg/L IBA中的生根率仅为75.3%；苔藓和草炭土均是“绿宝石”瓶外生根最好的扦插基质，其中以苔藓作为扦插基质时，苗生根后更方便运输。