植物源性食品中手性农药残留检测技术的研究进展

陈丹丹，万建春，郭 平，张 威，喻俊磊，吴 遥，王 栋*

(1.江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330001；2.江西中医药大学，江西 南昌 330004；3.南昌海关 技术中心，江西 南昌 330038)

手性农药是指含一个或多个手性中心的农药，只有约7%的手性农药以纯对映异构体或富含一种对映异构体的混合物的形式销售[1]。大部分手性农药都是以外消旋体的形式进行生产、销售和使用[2]。我国的农药市场中手性农药大概占40%[3]，可见手性农药的市场占比份额较大，手性农药通常由不同活性的对映体组成，对映体的分子式是相同的，其理化性质几乎都是一样的，在非手性环境下没有什么不同，但是在不同的手性环境下却表现出不同的生物活性、选择性、毒性等[4]。Zhang等[5]研究表明S-氟雷拉纳(S-Fluralaner)抗二化螟与灰飞虱的活性比R-氟雷拉纳(R-Fluralaner)高33～39倍。齐艳丽等[6]研究表明睛菌唑在番茄中降解表现为S-(+)-腈菌唑比R-(-)-腈菌唑先降解。潘兴鲁[7]研究表明啶菌噁唑对大型溞毒性的毒性表现为：(-)-RS-啶菌噁唑>(-)-RR-啶菌噁唑>Rac-啶菌噁唑>(+)-SR-啶菌噁唑>(+)-SS-啶菌噁唑；苯酰菌胺对映体对羊角月牙藻与大型溞的毒性表现为(-)-R-苯酰菌胺>Rac-苯酰菌胺>(+)-S-苯酰菌胺。陈增龙[4]研究表明在中性的砂质土壤中，R-(-)-呋虫胺优先降解导致S-(+)-呋虫胺相对富集，而在酸性与碱性的粉质土壤中降解选择性则相反，S-(+)-呋虫胺则优先降解。相关研究报道表明：不是所有手性农药的对映体都有生物活性，有的活性低，甚至还有毒性，对非靶标生物造成危害，因此加强对手性农药的分离，以获得有生物活性的单一的手性农药对映体对绿色农药的发展存在益处，既能对靶标生物发挥较好的生物活性，又不会对非靶标生物、环境等造成危害。

1 手性农药

农药是指用于预防、控制或消灭病、草、虫等有害生物及有目的地调节植物生长的化学合成品，或源自生物、其他天然物质的一种物质或几种物质的混合产物及其制剂[7]。手性是指物质本身与其镜像分子呈左右手对称但又不能重叠的关系，是一种普遍存在的现象，组成生命体的必需氨基酸、蛋白质等都有手性特征[8]。C原子是最常见的手性中心，连有4个不同原子或官能团的C原子为手性碳或为不对称碳，N、P、S等原子也可形成手性中心[9]。含一个或一个以上的手性中心，有一对或是多对对映体的农药为手性农药。手性农药的表示方法[10]：(1)以R、S来表示手性物质中手性原子的空间结构，R代表顺时针方向，S代表逆时针方向；(2)使平面偏振光右旋的是右旋体(以“+”表示)，反之则是左旋体(以“-”表示)，等量的左右旋体组成的物质为外消旋体(旋光度为0)(以“±”表示)；(3)以D-(+)-甘油醛与L-(-)-甘油醛为标准确定分子的构型。

2 手性农药的分类

2.1 拟除虫菊酯类

拟除虫菊酯类(Synthetic Pyrethroids)农药是广泛使用的手性杀虫剂[11]，具有高药效、杀虫谱广、低残留、易降解等特点[12]。拟除虫菊酯农药作用机制是通过作用于神经系统的轴突膜，与钠通道相互作用而影响电脉冲的传递[13]。拟除虫菊酯类农药几乎不溶于水[14]，由于其有机氯、有机磷等农药的毒性较大，所以逐渐被拟除虫菊酯类代替[15]，其大多含有1～3个手性中心[16]，主要有溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯、胺菊酯等。

2.2 有机氯

有机氯(Organochlorine Pesticides，OCPs)农药较难分解、化学性质稳定、易溶于脂肪和有机溶剂、不易溶于水[17]。有机氯农药因其高效性而被广泛使用，但其脂溶性强，能通过食物链富集于生物体中，进而威胁人类健康，具有免疫系统毒性、致癌、影响生殖与发育等毒副作用[17-18]。手性有机氯农药有狄氏剂、滴滴涕(DDT)、毒杀芬等。

2.3 有机磷

有机磷(Organophosphate Pesticide，OPPs)农药的作用机制是能够抑制目标物的乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，防止乙酰胆碱的水解，造成乙酰胆碱堆积，残留在水果、蔬菜中的有机磷农药在进入人体后会对人类产生潜在的毒性影响[19]，如神经系统毒性、内脏器官毒性、生殖系统毒性等[20]。有机磷农药一般不溶于水，但溶于动植物油和有机溶剂，对光、热、氧较稳定，遇碱易分解，一般情况下残效期较短[21]，被禁用的有机磷包括甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷和磷胺[22]。目前，批准使用的有机磷农药至少有30%含有1个手性中心[23]。手性有机磷农药主要分为磷手性(如灭蝇磷、丙溴磷等)、碳手性(如敌百虫、马拉硫磷等)、硫手性(如丰索磷等)；还有碳和磷2个手性中心，如噻唑磷、氯胺磷等。

2.4 三唑类

三唑类(Triazoles)农药具有1,2,4-三唑结构，大部分有1个或2个手性中心[24]，80%以上为手性农药[8]，其是应用广泛的杀菌剂，通过抑制原菌细胞膜的C14脱甲基甾醇的合成而具有活性[25]，有高活性、杀菌快速、杀菌谱广、强内吸性、低毒性等特点[26]。三唑类农药主要有丙环唑、三唑醇、戊唑醇、腈菌唑等。

2.5 除草剂

除草剂(Herbicide)是专门针对杂草、保护农作物的一类农药。根据化学结构将手性除草剂主要分为芳氧羧酸类(如禾草灵、炔草酯)、酰胺类(如甲草胺、双酰草胺)、咪唑啉酮类(如咪唑烟酸、咪唑喹啉酸)、环己烯酮类(如禾草灭、稀草酮)、尿嘧啶类(如炔草隆、除草定)、三嗪类(如密草通、三嗪氟草胺)[27-28]。

3 植物源食品中手性农药的检测

3.1 液相色谱法

液相色谱法适合于极性大、不耐热、不易挥发的物质，其分析速度快、进样量大，具有操作方便、重现性好、样品无需汽化、分析条件温和等特点。调节流动相的不同比例可实现对样品进行梯度洗脱分离，常与紫外检测器、质谱(MS)等多种检测器联用。液相色谱有正向色谱模式与反向色谱模式类型，正相色谱流动相包含烷烃(如正己烷)与醇改性剂(通常是乙醇或异丙醇)，反向色谱流动相为水或含水缓冲液与有机溶剂改性剂(通常为甲醇或乙腈)[1]，正相高效液相色谱比反相高效液相色谱有更高的分离效率[29]，但反相高效液相色谱因背景信号强度更低、样品制备过程更简单等优点，在手性分离中的应用发展迅速[1]。刘一平等[30]以(Chiralcel OD-H)手性色谱柱实现了对高效氯氟氰菊酯的拆分。Gao等[31]在反相液相色谱模式下拆分了甲基异柳磷，并建立了HPLC-UV检测法，可同时测定蔬菜、水果和土壤中手性农药甲基异柳磷的对映选择性方法，对映体在0.25～20 mg/L范围内线性良好，LOD为0.008～0.011 mg/kg，LOQ为0.027～0.037 mg/kg，平均回收率为83.2%～110.9%，且甲基异柳磷在小白菜中的立体选择性降解表明，(R)-(-)甲基异柳磷异构体的降解速度比(S)-(+)-异构体(t1/2=1.9 d)快。Sun等[32]对吡氟氯禾灵进行拆分，并建立环境基质(如土壤和水)中吡氟氯禾灵对映体的手性残留分析方法，吡氟氯禾灵的对映体在0.50～201.04 mg/L浓度范围内线性良好，土壤LOD为0.005 mg/kg，平均回收率为84%～90%；水LOD为0.001 mg/L，平均回收率为89%～101%。Shi等[33]建立了手性液相色谱-串联高分辨质谱分析水稻、稻壳与糙米中茚虫威对映体的方法，茚虫威在0.025～2.5 μg/mL浓度范围内线性良好，LOD为0.07～0.8 μg/kg，LOQ为6.25～25 μg/kg，平均回收率为74.00%～102.61%，通过研究茚虫威在贵州与湖南的水稻的降解行为表明S-茚虫威优先降解且不会发生对映体的转化，茚虫威在糙米中的残留浓度低于水稻植株与稻壳中的残留浓度。张春艳等[34]建立了反相高效液相色谱拆分氟环唑对映体的方法，并建立了氟环唑对映体在蔬菜水果及土壤中的残留分析方法，在0.1～10.0 mg/L之间氟环唑对映体的线性关系良好，LOQ为0.05 mg/kg，平均回收率为80.8%～96.7%。Yao等[35]对水胺硫磷及其代谢产物水胺氧磷进行拆分，并建立了手性高效液相色谱-串联质谱法同时测定大米、土壤与水中的水胺硫磷及其主要代谢物水胺氧磷的方法，在1～500 μg/L浓度范围内线性良好。水中LOD为0.1 μg/kg、大米和土壤为0.5 μg/kg；水中LOQ为0.5 μg/kg、大米和土壤为5 μg/kg，平均回收率分别为89.7～103%和90.1～98.7%。曾春等[36]对粉唑醇对映体进行拆分，并建立了快速测定粉唑醇对映体在香蕉中的残留量的方法，0.5～125 mg/L范围均具有良好的线性关系，平均加标回收率为93.4%～101.7%。张利强等[37]对手性苯醚甲环唑对映体的进行了拆分，并建立了苯醚甲环唑在火龙果中残留的分析方法，单个对映体在0.10～10 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，在0.4 mg/kg和2.8 mg/kg的外消旋苯醚甲环唑加标水平下，4个对映体的平均回收率分别为83.7%～99.3%与86.4%～91.6%。廖玉芹等[38]采用反向液相色谱模式下拆分了己唑醇、粉唑醇、灭菌唑、烯唑醇4种三唑类手性农药对映体，并建立了测定灭菌唑对映体在黄瓜中残留的方法，灭菌唑对映体在1～50 μg/mL范围内的线性关系良好，灭菌唑第一个对映体的加标平均回收率为92.54%，第二个对映体的加标平均回收率为93.16%，黄瓜中两对映体的LOD小于20 μg/kg。骆冲等[39]建立了超高效液相色谱-串联质谱技术分析菜心与油麦菜中手性农药多效唑、腈菌唑、甲霜灵、三唑酮与噁唑菌酮的方法，5种手性农药在0.005～1.0 mg/L浓度范围内线性良好，LOD为0.005 mg/kg，LOQ为0.01 mg/kg，平均回收率为68.8%～104.0%。张宏福[40]对手性三唑类农药己唑醇进行了拆分，并建立苹果中己唑醇残留分析的方法，己唑醇在0.5～125 μg/mL浓度范围内对映体的线性关系良好，己唑醇两对映体的平均回收率为88.0%～97.2%。表1列举了液相相色谱法分离手性农药的分析方法。

表1 液相色谱法分析手性农药对映体

3.2 气相色谱法

气相色谱法与高效液相色谱相比，气相色谱更适合非极性、热稳定性良好、易于挥发的物质，其具有进样量小、灵敏度高、检测限低等优点。Wang等[41]建立气质联用测定蔬菜中乙酰甲胺磷与甲胺磷对映体的分析方法，结果显示对映体在蔬菜中的代谢是有选择性的，采用QuEChERS方法对蔬菜进行前处理，在蔬菜中的平均回收率为71.87%～81.45%，相对标准偏差小于8.81%。潘蓉等[42]建立了茶叶中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的拆分及分析方法，茶叶中甲胺磷回收率在58.3%～66.4%之间，乙酰甲胺磷在50.8%～57.6%之间，在绿茶基质中甲胺磷和乙酰甲胺磷的检出限有所不同，实验发现(+)-乙酰甲胺磷的降解略比(-)-乙酰甲胺磷快，乙酰甲胺磷在降解过程中更易产生(+)-甲胺磷。Natalia Fidalgo-Used等[43]建立了2种分析河水、果汁等样品中育畜磷的方法。研究发现ECD、ICP-MS两种检测器中ICP-MS比ECD的选择性好、灵敏度高，2种检测器在检测限浓度～250 ng/mL范围内，线性良好，加标回收率约83%以上。戴守辉等[44]建立了测定莲藕及泥底的PCB方法，在0.5～100 μg/L范围内线性良好，加样回收率在82.8%～117%之间，在市售莲藕样品未检出6种手性农药，但污染区莲藕、荷茎和荷叶中PCB95-1、PCB91-2和(+)-PCB136含量均高于其对应的对映体含量，其余的手性PCB两个对映体浓度则相接近。Li等[45]建立了分析测定谷物及果蔬中硅氟唑的方法，在10～5000 μg/kg范围内，线性良好，硅氟唑的回收率大于86.7%。表2列举了气相色谱法分离手性农药的分析方法。

3.3 毛细管电泳法

毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)[46]，毛细管电泳是一类以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道的新型分离分析技术，样品中各组分的淌度与分配行为存在差异而实现分离，是微柱分离与经典电泳相结合的技术[47]。CE通常使用手性添加剂构建手性环境来实现对映体的分离，对映体与手性选择剂的结合常数存在差异，而导致对映体的表观淌度的不同，所以可用CE进行分离[48]。根据分离模式的不同可将CE分为毛细管区带电泳(CZE)、毛细管电色谱(CEC)、毛细管等速电泳(CITP)、毛细管凝胶电泳(CGE)及胶束电动毛细管色谱(MEKC)等[49-50]。刘银[49]采用环糊精(β-CD)-毛细管区带电泳(CZE)法在缓冲液25 mmol/L磷酸盐-20 mmol/L β-CD(pH=12.5)条件下拆分稀草酮、吡喃草酮、灭草喹、甲氧咪草烟，同时以二元环糊精为手性添加剂，以50%甲醇-50%水为样本溶剂，在缓冲液为40 mmol/L丙基环糊精(HP-β-CD)-10 mmol/L 2,6-二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)-90 mmol/L十二烷基磺酸钠(SDS)-25 mmol/L硼砂-10%乙腈(pH=8.5)情况下用毛细管胶束电动色谱法(MECC)成功拆分了粉唑醇、灭菌唑、氟环唑与乙螨唑对映体。张梦薇[48]以40 mmol/L γ-CD-75 mmol/L H3PO4-100 mmol/L SDS(pH=2.0)的缓冲溶液，采用毛细管电泳胶束电动色谱(MEKC)拆分2-苯氧基丙酸(2-PPA)、2-(4-氯苯氧基)丙酸(2,4-CPPA)、2-(3-氯苯氧基)丙酸(2，3-CPPA)、2,4-滴丙酸(Dichlorprop)、2,4,5-涕丙酸(Silvex)。张宏福等[51]采用毛细管电色谱(CEC)方法，以磺丁基醚-β-环糊精开管毛细管柱(SECDP)为电色谱柱，3 mmol/L-(SBE-β-CD)-15%(体积分数)甲醇-10 mmol/L的硼酸盐(pH=9.2)对粉唑醇进行拆分，并建立了果蔬(黄瓜、梨、苹果与番茄)中粉唑醇分析检测残留的方法，粉唑醇对映体在1.3～250 μg/mL范围内线性关系良，LOD为25 μg/kg，第一对映体回收率为94.6%～95.8%，第二对映体回收率94.5%～98.6%。李佳等[52]采用高效毛细管电泳(HPCE)在15976 mg/L DM-β-CD-5332.0 mg/L乙酸缓冲溶液(pH=5.8)条件下，实现了精喹禾灵对映体的拆分，该方法可用于精喹禾灵的定性定量分析。陈巧梅等[53]采用毛细管加压电色谱(pCEC)对烯效唑、烯唑醇和丙环唑实现了同时拆分，色谱柱为C18硅烷化修饰的亚微米SiO2微球装填成毛细管色谱柱，以20 mmol/L羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)-乙腈-20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=6.8)(45/55，v/v)为流动相，施加电压-9.4 kV，在12 min内烯效唑、烯唑醇及丙环唑依次得到分离。虞婕等[54]以5 mmol/L β-CD-2.5%异丙醇-75 mmol/L NaH2PO4-5 mmol/L NH4H2PO4为缓冲溶液，在20 min内实现了对抑霉唑对映体的拆分。Angeles等[55]通过毛细管胶束电动色谱(MEKC)对生物丙烯菊酯杀虫剂进行立体选择性分离，对映体在6.5 min内完成分离，且分离度大于1.5。且外消旋体对绿藻的毒性大于S异构体，外消旋体与S-生物丙烯菊酯会抑制高粱种子的萌芽。表3列举了毛细管电泳分析手性农药对映体的检测方法。

表3 毛细管电泳分析手性农药对映体

4 小结

手性农药其空间构型不同，药效作用、降解时间、毒性大小等都有较大的差异，为了更好地发挥农药的药效，最大程度地减小其对非靶向目标物等的毒害作用，建立手性农药的拆分及对其残留量进行分析检测有充分的必要性。当前已有很多先进的技术手段被用到了植物源性食品中手性农药的拆分与残留检测，如GC与LC。LC与GC通常用手性柱实现对手性农药的拆分，但手性柱的经济成本较高，且GC拆分手性农药的分析时间偏长，通常情况下，一个特定的手性柱只能拆分某一种或某几种手性农药，因此其应用有较大的限制性，实用性较差。GC对手性农药的拆分要求其耐高温、有挥发性等。如若是非挥发性手性农药则还需要衍生，在高温情况下手性农药对映体还有可能会相互转化等[28]，则就失去了原本分离分析的意义。LC要求手性农药热稳定性差、不宜挥发、极性大等。CE作为近年来发展的分离技术，与GC、LC相比,CE具有分离效率高、分析速度快、样品用量小(nL级～fL级)、溶剂与试剂消耗量少、运行成本低、分离模式多、绿色环保等优点[56]。但与LC、GC相比,CE对检测器的灵敏度要求高，重现性差，其实际应用会有所限制。除了以上的技术用于手性农药残留的分析检测之外，还有其他的检测技术，比如超临界流体色谱(SFC)，以固体吸附剂或键合到载体(或毛细管)的高聚物为固定相，超临界超临界流体(常用超临界CO2)与少量有机溶剂作为流动相的色谱，有机试剂耗量小，绿色环保经济，柱效高，分析时间短[57-58]。徐明仙等[59]以Sino-Chiral OJ为手性固定相，用SFC对氯菊酯、氰戊菊酯、联苯菊酯等6种手性农药进行拆分。超高效合相色谱以超临界CO2与一定量甲醇、乙腈等溶剂(助溶作用)作为流动相，利用超临界流体的溶剂化能力来实现物质的分离分析，对于GC而言，其可分析难挥发、受热不稳定、高沸点的物质，与传统流动相相比其传质效率更高[60-61]。张文华等[62]利用UPC2实现了三唑酮、三唑醇、己唑醇等手性农药的拆分，并建立了其在黄瓜中的残留量的检测方法。

植物源性食品的安全关乎人体健康与生命安全，手性农药品种较多，而植物源性食品基质也比较复杂，当前还没有一种拆分技术可以将所有手性农药同时拆分，也没有一种分析检测方法可以将所有残留于植物源性食品中手性农药定量检出。因此研究可同时拆分多种手性农药的技术，以及准确、简捷、高效、快速、灵敏测定植物源性食品中手性农药多残留的方法将是手性农药残留检测的关键所在。