丁苯草酮原药液相色谱分析方法研究

徐成辰 吴晗 吕霞 杨淑娴

(江苏省农产品质量检验测试中心，江苏 南京 210036)

环己二酮类(环己烯酮类)除草剂是一类低毒、高效、广谱的内吸传导型除草剂[1,2]，通过抑制乙酰辅酶A羧化酶而起作用，主要用于防治禾本科杂草[3,4]。其最先由日本曹达公司开发，目前共有十多个品种商品化，其中包括烯草酮、三甲基苯草酮、烯禾啶、吡喃草酮、噻草酮、环苯草酮和丁苯草酮等[1,5]。丁苯草酮是捷利康公司开发的一种环己二酮类除草剂，适用于棉花、油菜、豆类、甜菜等阔叶作物，对冬草等杂草防除活性优异，且见效快[6,7]。

目前，在国内登记生产的环己二酮类除草剂品种有烯草酮、三甲基苯草酮和烯禾啶，丁苯草酮也有部分企业在登记过程中。国内对丁苯草酮的研究，主要在残留检测以及市场开发[8]方面，尚无相关标准发布和分析方法的研究报道。为了满足企业生产质控的需求，同时为市场监管等工作做前期准备，本文采用高效液相色谱技术建立了一种适用于丁苯草酮原药中有效成分定量分析的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Agilent-1100型高效液相色谱仪配备二极管阵列紫外检测器及色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；超纯水制备系统(默克密理博公司)；AS-3120B超声波清洗机(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；针筒过滤器，0.45μm孔径滤膜(默克密理博公司)。

1.2 试剂和溶液

乙腈，色谱纯(德国Merck公司)；磷酸，分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；超纯水；丁苯草酮标准品，已知质量分数含量≥97.0%(外购)；丁苯草酮原药(外购)。

1.3 色谱操作条件

色谱柱使用Zorbax SB-C18不锈钢柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈加0.1%磷酸水溶液=75+25(V/V)；流动相流速为1.0mL·min-1；柱温为30℃；检测波长为254nm；进样体积为5μL。在上述色谱操作条件下，丁苯草酮的保留时间约为6.6min。丁苯草酮标准品、丁苯草酮原药的高效液相色谱图分别见图1、图2。

图1 丁苯草酮标准品的液相色谱图

图2 丁苯草酮原药的液相色谱图

1.4 质量分数测定步骤

1.4.1 配制标准品溶液

准确称取丁苯草酮标准品0.03g(精确至0.00001g)，置于50mL容量瓶中，添加45mL乙腈，超声振荡5min，使标准品完全溶解，冷却恢复至室温，用乙腈定容，摇匀。

1.4.2 配制原药试样溶液

准确称取含丁苯草酮的试样0.03g(精确至0.00001g)，置于50mL容量瓶中，添加45mL乙腈，超声振荡5min，使试样完全溶解，冷却恢复至室温，用乙腈定容，摇匀并用0.45μm过滤器过滤。

1.4.3 进样测定

按照1.3中操作条件，在仪器基线稳定后，连续进行标准品溶液的测定，直至连续两针峰面积的变化<1.2%后，以标准品溶液、试样溶液、试样溶液、标准品溶液的次序进样并分析计算。

1.4.4 质量分数的计算

分别将连续测定两针试样溶液及试样前后标准品溶液的峰面积算平均值，并按以下算式计算丁苯草酮的质量分数(X)：

式中，m1为丁苯草酮标准品的称样质量，g；m2为试样的称样质量，g；F1为标准品溶液的丁苯草酮峰面积平均值；F2为试样溶液的丁苯草酮峰面积平均值；r为标准品中丁苯草酮质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

按照1.4.1配制丁苯草酮标准样品溶液，利用高效液相色谱仪的二极管阵列检测器进行紫外光谱扫描(190～500nm)，所得丁苯草酮的紫外吸收光谱图见图3。由图3可知，丁苯草酮在200nm、254nm两处均存在紫外吸收峰值。考虑200nm处紫外波长较短，容易产生紫外吸收的杂质较多，为减少干扰选择254nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

本试验选择了安捷伦Zorbax SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)色谱柱进行方法建立。流动相选择了3种不同溶剂体系进行初步测试，乙腈/水、乙腈/0.1%磷酸水溶液、乙腈/0.1%乙酸水溶液。试验发现，选择乙腈/0.1%磷酸水溶液体系，在1.0mL·min-1流速下，丁苯草酮与杂质可以得到较好的分离。以此为基础，将不同比例的乙腈和0.1%磷酸水溶液混合并分别进行测试，当有机相占比过大时，出峰较快，导致丁苯草酮和杂峰分离效果不好；而当有机相占比过小时，出峰太慢，影响峰形和检测效率。根据丁苯草酮和杂质峰的出峰时间、分离效果、峰形以及峰纯度进行综合考虑，当使用乙腈加0.1%磷酸水溶液=75+25(V/V)时，丁苯草酮色谱峰峰形及峰纯度较好，且能兼顾分离度与检测效率，保留时间约6.6min，见图1。

2.2 方法特异性试验

本试验采用HPLC-DAD峰纯度分析法来鉴别丁苯草酮。分别配制标准品溶液和试样溶液按1.3操作条件进行峰纯度测试。测定结果表明，标准品和原药两者中的有效成分峰纯度均高于990，无其它杂质成分干扰，满足定量分析的要求。丁苯草酮标准品、丁苯草酮原药的峰纯度色谱图分别见图4、图5。

图4 丁苯草酮标准品HPLC-DAD峰纯度色谱图

图5 丁苯草酮原药HPLC-DAD峰纯度色谱图

2.3 方法线性关系的测定

按照标准品溶液的配制方法制备5个浓度不同的丁苯草酮标准品溶液，并进行线性测定。按1.3操作条件，分别测定每个标准品溶液的丁苯草酮峰面积，2次测定取平均值。以有效成分质量浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标绘制线性关系图，见图6。

从图6可知，在172.66～1753.76mg·L-1质量浓度范围内(进样体积5μL)，丁苯草酮的质量浓度与对应的峰面积线性关系良好，其线性回归方程为y=8.5577x-69.847，相关系数为0.9998，可以满足定量分析的要求。

图6 丁苯草酮的线性关系图

2.4 方法精密度的测定

按照试样溶液的配制方法制备5个丁苯草酮原药的样品溶液，在1.3操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标准品溶液、精密度样品溶液、精密度样品溶液、标准品溶液的顺序进行精密度测定，结果见表1。

从表1可知，丁苯草酮原药中丁苯草酮质量分数测定结果的变异系数(RSD)为0.2797%，而修改的Horwitz公式2(1-0.51ogC)×0.67=1.3465，变异系数测定结果远小于公式计算值，表明此分析方法的重复性测定结果能够满足定量分析的精密度要求。

表1 丁苯草酮原药中丁苯草酮重复性试验结果

2.5 方法准确度的测定

为了验证方法的准确度，进行有效成分的回收率试验。称取含0.015g(精确至0.00001g)丁苯草酮的丁苯草酮原药于50mL容量瓶中，再加入丁苯草酮标准品0.015g(精确至0.00001g)，按照试样溶液的配制方法制备了5个有效成分准确度溶液。在1.3操作条件下，待仪器基线稳定后，按照标准品溶液、准确度样品溶液、准确度样品溶液、标准品溶液的顺序进行测定，准确度测定结果见表2。从表2可知，丁苯草酮原药中丁苯草酮平均回收率为100.17%，说明有效成分分析方法准确度较好，测定结果符合定量分析的回收率要求。

表2 丁苯草酮原药的准确度试验结果

3 结论

本文采用配备紫外检测器的高效液相色谱仪建立了一种测定丁苯草酮含量的分析方法，使用Zorbax SB-C18色谱柱、流速为1.0mL·min-1的乙腈/0.1%磷酸水溶液混合溶液为流动相，在检测波长254nm下进行分离测定。该方法具有操作简便快速，线性关系良好，特异性、精密度、准确度较高、有效成分分离效果好等特点，可用于丁苯草酮原药常规分析和质量控制。