环境激素对鱼类生殖毒性的研究进展

刘晓东 王韩信 苏明

(1 上海市水产研究所，上海市水产技术推广站，上海 200433；2 上海市青浦区水产技术推广站，上海 201700)

根据《2019中国生态环境状况公报》和《2019年中国海洋生态环境状况公报》，全国地表水监测的1 931个水质断面(点位)中，Ⅰ～Ⅲ类地表水占74.9%，与2018年相比上升3.9%；劣Ⅴ类地表水占3.4%，同比下降了3.3%。海洋环境方面，Ⅰ类水质海域面积占管辖海域面积的97.0%，比2018年上升0.7%；劣Ⅳ类水质海域面积28 340 km2，比上年减少4 930 km2。数据表明，我国水环境质量持续改善，海洋水环境稳中向好[1]。但有一些污染物很难降解，将会长期存在，还有很多已知的污染物短期内难以彻底禁用，此外还有更多的新型化合物在不断面世，这些都是环境的监管和保护仍要面临的严峻挑战。

环境激素 (endocrine disruptors or endocrine disrupting chemicals)在水体中具有持久性或伪持久性，会影响水生动物的性别分化，导致性逆转、性腺异常发育、生殖机能和行为异常，从而造成种群数量下降甚至灭绝[2-3]。同时，环境激素还会通过食物链的传递影响人类健康，导致人类发育异常、生殖功能障碍等[4]。鱼类是水体中环境激素的直接暴露者，又是人类重要的动物蛋白来源。因此，无论从环境保护、生态安全或是食品安全角度来看，开展环境激素对鱼类生殖毒性的研究均具有重要意义。另外，生殖性功能异常也是化合物评价的重要指标之一[5-8]，而鱼类是该领域研究的重要模式物种[9]。因此，笔者检索、整理了近年来该领域的相关研究成果，综述水环境激素的种类及其对鱼类毒理、生殖毒性的常用研究方法，并以有机锡污染物为例，细述环境激素对鱼类生殖的影响，并提出未来研究的展望。

1 常见的环境激素

水体中的环境激素种类繁多，结构各异，一般按其来源不同可分为天然化合物和人工合成物。前者包括天然雌激素、微囊藻毒素等。绝大多数环境激素来自工农业生产等人类活动排放的污染物及其代谢降解产物，包括除草剂、杀虫剂、药物、工业化合物和重金属等(见表1)[10-32]。

表1 水体中常见的环境激素及其毒性机理Tab.1 Widespread endocrine disruptors and their toxic mechanism

2 鱼类生殖毒理研究方法

体内实验是鱼类生殖毒理研究中常用的传统方法。体内实验中，实验对象及其发育阶段，暴露方式等是关键影响因素。近年来，随着相关技术理论的发展，体外实验也受到越来越多的重视和应用。另外，由于野外环境的复杂性，模拟实验常常无法完全反映野外的真实情况，因此，开展野外实验意义重大。

2.1 体内实验

2.1.1 实验对象

多数鱼类为体外受精，体外发育，且胚体透明，便于开展生殖毒性研究，对鱼类生殖毒理的研究结果可在很大程度上用于预测对脊椎动物的影响[33]。因此，早在20世纪40年代，一些鱼类就被广泛用于毒理研究，其中主要是鲑科鱼类(Salmonidae)、太阳鱼(Lepomismacrochirus)、金鱼(Carassiusauratus)等大型鱼类。20世纪60—70年代，为了便于开展长期暴露实验，开始更多地采用繁殖周期较短的小型鱼类[9]，如黑头软口鲦(Pimephalespromelas)、斑马鱼(Daniorerio)和青鳉(Oryziaslatipes)，这3种小型鱼类都具有性成熟时间短、产卵间隔短、容易饲养、适合小型水体培养、对毒物敏感等先天优势，同时其发育、遗传、基因组、免疫等基础研究数据丰富，并已建立了多种稳定的品系[33-34]，已成为国际普遍认可的毒理学研究模式生物，广泛应用于环境激素筛选，也是经济合作与发展组织(OECD)化合物测试系列导则中鱼类繁殖试验推荐的受试鱼类(见表2)[5-8]。

表2 OECD化学品测试导则中鱼类生殖试验方法Tab.2 Experiment design for fish reproduction assay in OECD guidelines for the testing of chemicals

近年来，我国特有的小型鲤科鱼类稀有鱼句鲫(Gobiocyprisrarus)也逐渐成为重要的模式生物。稀有鱼句鲫同样具有产卵间隔短、性成熟时间短、适合小型水体培养等先天优势。而且，我国科研工作者从1990年起，就以培育新的实验动物为目的，对稀有鱼句鲫开展了多学科的系统研究，建立了近交系和野生封闭群2个品系，探明了其对重金属、挥发性有机物、苯胺类、含氯消毒剂、农药等污染物普遍敏感，陆续研究制定了使用稀有鱼句鲫作为毒性试验材料鱼的相关标准和规范，生态环境部也已将稀有鱼句鲫列为新的化学物质测试推荐鱼种[34-36]。采用稀有鱼句鲫为受试对象的相关研究越来越多[29,37]，作为土著鱼类，它具有更好的代表性，更加具有生态指示意义[38]。

因为土著鱼类本身就是重要的保护对象，所以开展土著鱼类的毒理研究，对特定污染事件或特定生物群落、特定生态系统的研究，以及对水环境基准的制定都是非常必要的。2017年，我国环保部发布的《淡水水生生物水质基准制定技术指南》中，推荐的受试鱼类除国际通用的模式生物外，还包括10种我国广泛分布的土著鱼类[39]。近年来，我国学者从生态和物种保护、食品安全以及服务养殖生产等角度开展了大量关于土著鱼类的毒理学相关研究。例如，赵岩等[40]报道了BPA对雄性泥鳅卵黄蛋白原(Vtg)水平的影响和诱导Vtg的最低浓度(1 μg/L)，吕雪飞等[41]报道了BPA与E2联合暴露对泥鳅(Misgurnusangaillicaudatus)的Vtg诱导效应。陈玉明等[42]开展了硫酸铜对泥鳅(M.angaillicaudatus)精子活力影响的体外试验。

2.1.2 暴露方式

生殖毒性实验常见的暴露方式包括水环境暴露、饵料暴露以及体内注射暴露等。暴露方式会影响鱼类对毒物的吸收和累积路径。Harrison等[43]对虹鳟(Salmogairdneri)和白鲑(Coregonusclupeaformis)的研究表明，通过水环境暴露的镉(Cd)主要累积在鳃和肾脏，而通过饵料暴露则主要累积在肠道和肾脏；Lee等[44]对尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的研究表明，经水环境暴露的铅(Pb)在不同器官的沉积量为肾脏>肝脏>鳃>性腺和脾脏>脑>肌肉，而饵料暴露时则为肠道>胃>肝脏>肾脏>骨骼>鳃>脾脏>精巢>肌肉>脑。暴露方式还会影响毒物在鱼体的累积量。例如，Alsop等[45]的研究表明，在水体铅浓度相同的条件下，单独水环境暴露导致的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)体内铅的累积量是单独经饵料(带丝蚓Lumbriculusvariegatus)暴露的20～60倍。

水环境暴露是鱼类生殖毒性研究中最常采用的方式。生殖毒性研究一般都需进行慢性试验，期间的养殖和维生操作很容易引起水环境变化，从而改变环境激素对鱼体的毒性作用。这些水环境因素包括pH、温度、有机碳、硬度、溶解有机物、富营养化程度等[46-49]。因此，水环境暴露试验中，养殖和维生操作应尽量减少水质波动，保持环境稳定。

采用注射暴露，环境激素的用量大大减少，但需要逐尾注射。注射操作会使受试鱼产生应激反应，而应激反应可能影响多种下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴相关的激素水平[50-51]，从而影响试验结果。但根据Kahl等[52]的研究报道，在间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)麻醉状态下，对黑头软口鲦(P.promelas)进行1次或在1周内连续3次腹腔空白注射，受试鱼除雌鱼血浆Vtg水平升高外，其性腺指数(GSI)、卵子受精率和孵化率、雌鱼血浆中的雌二醇(E2)水平、雄鱼睾酮(T)和11-酮睾酮(KT)水平、雄鱼血浆Vtg水平均与空白组无显著差异，表明注射操作不会干扰试验结果。这可能是由于注射操作持续时间很短，同时也与具体的操作过程有关。

饵料暴露试验时，在饵料中添加激素的方式可能会对试验结果产生重大影响。例如，Hodson等[53]将硝酸铅混入牛肝，经匀浆、冷冻干燥、粉碎后再混入配合饲料。在32周的试验中，并未发现受试鱼体内有铅累积，而是全部通过粪便排出。但此后采用其他饵料载体进行铅暴露的研究表明，饵料暴露会导致鱼体内铅的累积[44-45]，说明是由于添加方式而导致铅未被受试鱼吸收。

2.1.3 发育阶段

鱼类早期发育阶段是对环境激素的敏感时期[33]，往往低剂量的暴露就会对性腺分化产生不可逆转的影响；繁殖阶段的暴露会影响亲本繁殖力、卵子的质量和受精率、受精卵的孵化率以及子代的成活和生长发育。例如，Mcallister[54]研究表明，斑马鱼(D.rerio)仔鱼经极低浓度(0.01 ng/L)的三丁基锡(TBT)暴露，群体雄性比例明显提高；Nimrod[55]对青鳉(O.latipes)的研究也表明，仔鱼经0.01 μg/L的低浓度E2暴露后，全部转变为雌性。Kang等[56]对繁殖期的青鳉(O.latipes)进行E2暴露，导致产卵数量减少、受精率降低，雄鱼出现性腺间性和Vtg水平显著升高现象。

全生命周期、甚至多代实验对全面了解环境激素对鱼类的影响非常重要。鱼类全生命周期实验一般指暴露期从24 h以内的胚胎直到性成熟并繁殖，或者直到子代发育至幼鱼阶段。Chen等[57]研究指出，对于不同阶段的斑马鱼，BPA暴露对其精液量、精子密度和活力、子代的畸形率的影响不同。Ma等[58]、Xie等[59]开展了2-溴-4，6-二硝基苯胺(DBNA)对斑马鱼毒性的多代暴露实验，结果表明，亲代暴露会对F0、F1和F2代分别产生不同的影响。

2.2 体外实验

体外实验可以更好地开展作用靶位、毒性机理及遗传毒性等研究，能够以低成本开展高通量的污染物筛选，同时也更符合动物实验中减少(Replacement)、替代(Reduction)、优化(Refinement)的3R原则[60]。对精子活力和功能影响的研究常采用体外实验。Hatef等[61]综述了污染物对鱼类精子功能的影响：污染物通过破坏精子质膜、轴丝、干扰能量代谢、破坏运动器官等影响精子活动能力、活动时间、运动速率以及受精能力，归纳出受试精子的质量、体液污染、精液的保护作用、精子活力和受精能力在繁殖季节期间的变动情况，指出实验条件控制是影响精子体外实验结果的关键因素。

雌激素受体也是较为常用的环境激素体外实验工具。Chakraborty等[62]研究了DDT、E2、硫丹、双甲脒、乐果、七氯、溴氰菊酯、高灭磷、多菌灵等多种环境激素对青鳉(O.latipes)3种雌激素受体的影响，并结合体内实验分析了3种受体在青鳉生殖发育中的功能及外源E2的影响机制。Lange等[63]比较了多种天然和人工合成雌激素对模式生物斑马鱼(D.rerio)、青鳉(O.latipes)、黑头软口鲦(P.promelas)、三刺鱼(G.aculeatus)以及环境监测中常用的鲤鱼(Cyprinus.carpio)和虹鳟(O.mykiss)雌激素受体的敏感性，并证明了体外受体激动效应与传统的指标Vtg诱导效应的良好相关性。目前，利用体外实验开展污染物筛选和毒理研究仍面临一些困难和挑战，例如，对很多环境激素体内作用途径和毒理学终点并不足够清晰，尚需针对不同的细胞或细胞系建立特定的标准化模拟生理环境，以及大量环境激素的环境行为基础数据[64-65]。

2.3 野外实验

根据实验室模拟实验的结论推导自然条件下毒物对生物的影响是生态毒理学中常用的研究方法[9]。但是，模拟试验的环境条件相对简单且稳定，而野外条件复杂，涉及环境激素的环境行为、相互作用、环境条件的影响以及生态系统的结构和功能等。例如，水环境中的无机汞很少被鱼类直接吸收，主要是经过微生物和藻类的甲基化作用后进入水生食物链后方在鱼体内富集，浮游植物和微生物等对汞的富集情况可以较好地预测鱼体汞的累积量，水体总有机碳浓度、富营养化状态等会影响汞的生物富集及其沿食物链的生物放大[66-67]。有研究已证实，环境中的多氯联苯(PCBs)会在罗非鱼体内富集[68]。但Barber等[69]发现，在1个PCBs浓度较高的污水处理厂人工湿地内，罗非鱼(Tilapiamossambica)体内PCBs的浓度却极低，这可能是环境条件、食性不同以及多种污染物的相互作用导致的。Dale等[70]通过设置养殖网箱研究了垃圾场附近海域污染物对大西洋鳕鱼(Gadusmorhua)的影响，结果表明，富集PCBs最高的鳕鱼网箱并不在海底PCBs最高区域，而且虽然PCBs在鱼体富集，但检测PCBs的分子标记Cyp1a在基因表达或蛋白水平方面均无显著改变。上述研究可见野外实验的复杂性及其与实验室研究的差异性。因此，开展野外实验以及种群和生态系统等宏观尺度的研究意义重大。但目前这方面的研究相对缺乏。

3 有机锡化合物对鱼类生殖的影响

有机锡化合物被广泛地应用于用于木材、船舶的防腐，是水体中常见的污染物。Jiang等[71]的监测表明，1998—1999年间，中国东南沿海主要港区及滇池、白洋淀等水体的TBT含量在0.8～976.9 ng/L(以锡的量计)，仅有少数监测点浓度低于0.5 ng/L的最低检出限。有机锡通过抑制雌激素合成途径关键酶、干扰雌激素核受体基因表达等，导致鱼类雄性化、破坏性腺和生殖细胞的结构功能、改变正常的生殖行为。以下以TBT、TPT等有机锡污染物为例，综述其对鱼类性生殖的影响。

3.1 导致鱼类雄性化

TBT早期暴露会导致不可逆转的雄性化现象。McAllister等[54]对斑马鱼(Daniorerio)的研究表明，初孵仔鱼经TBT暴露70 d，停止暴露至成熟时，群体雄性比例明显提高。Santos等[72]报道了在TBT与乙炔基雌二醇(EE2)联合暴露中，EE2抵消TBT引起的斑马鱼雄性化现象，范家诚等[73]的研究表明，E2和TBT同时暴露，当TBT浓度较高时，能够抑制E2对卵黄蛋白原基因vtg1和雌激素受体基因esr1的表达诱导作用。Shimasaki等[74]用对35～100日龄的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)进行饵料途径TBT暴露(添加量为0.1和1.0 μg/g)，结果受试鱼的雄性比例明显提高，同时P450-arom基因表达下降。这些研究说明，TBT作为芳香化酶抑制剂会使雌激素合成受阻，从而导致作用对象雄性化。

3.2 破坏性腺和生殖细胞的结构和功能

TBT对雌、雄鱼影响不同。雄鱼方面，McAllister等[54]报道了TBT引起斑马鱼(D.rerio)精子鞭毛数量减少、精子活力下降现象；Nakayama等[75]报道了TBT暴露导致青鳉(O.latipes)受精率下降；范立民等[76]报道，氯化三丁基锡(TBT-Cl)导致罗非鱼(O.aureus)精巢细胞凋亡率显著提高。针对TBT会影响精子质量的现象，Thresher等[18]用非类固醇类芳香化酶抑制剂法处理斑马鱼(D.rerio)和青鳉(O.latipes)，结果同样会导致精子活动能力下降、活动持续时间减少以及精子畸形，证实了此前关于雌激素在精子发育过程中发挥关键作用的假说，说明TBT对于精子的影响也与芳香化酶抑制有关。周群芳等[77]对稀有鱼句鲫(G.rarus)的研究表明，经TBT-Cl暴露2周，雄鱼成熟系数(GSI)显著提高。但Zhang等[23]在对褐菖鲉(S.marmoratus)的研究中却发现，TBT暴露导致雄鱼GSI下降，同时出现精巢小叶间隔间质纤维化严重、支持细胞功能受到破坏、精巢小叶间隔脂肪滴量提高、总脂含量增加等。Sun等[78]也发现，TPT会导致褐菖鲉雄鱼GSI下降，精巢组织学改变等类似现象。此外，吴鹏等[79]报道，TBT-CL会导致卵胎生鱼类孔雀鱼(Poeciliareticulata)雄性生殖足指数增加。

雌鱼方面，Xiao等[80]报道，TBT暴露导致斑马鱼(D.rerio)雌鱼性腺指数、产卵量、受精卵的孵化率以及仔鱼的成活率都显著下降，卵巢内卵泡总数减少，且早期卵泡比例显著增加，发育后期卵泡明显减少。Zhang等[81-82]报道，TBT暴露导致褐菖鲉(S.marmoratus)雌鱼卵黄生成期卵泡比例下降，早期的卵泡比例上升，卵泡凋亡显著增加，卵巢中性脂质颗粒减少，间质异位脂质和总脂升高，卵巢和卵母细胞的功能受到影响。Horie等[83]对于青鳉(O.latipes)的研究表明，TBT会导致雌鱼肝脏Vtg水平和产卵量显著降低。此外，Zhang等[84]从TBT对雌、雄鱼芳香化酶Cyp19b、雌激素受体基因ERα、ERβ等相关基因表达的不同影响方面报道了TBT影响的性别差异性。

3.3 影响生殖行为

有机锡化合物还会影响鱼类的生殖行为。Zhang等[85]研究发现，TPT暴露会使孔雀鱼(P.reticulata)雄鱼的“sneaking attempts”行为(即从后方追逐雌鱼并试图交配的行为)出现频率显著增加，这可能与TBT导致其体内T水平上升有关。但雄鱼皮肤类胡萝卜素含量下降，体色变暗，对雌鱼的吸引力降低。这可能是TBT导致体内氧化应激，消耗了类胡萝卜素所致，表明TBT还可能通过引起氧化应激等其他途径导致鱼类生殖异常。Xiao等[80]也报道了斑马鱼(D.rerio)经TBT暴露后，雌、雄鱼在产卵区停留时间都明显减少的现象。Nakayama等[75]对青鳉(O.latipes)进行TBT以及TBT和PCBs联合暴露后，发现主动求偶的雄鱼数量以及雄鱼求偶行为的出现频率都显著降低。鱼类生殖行为与体内类固醇激素以及生物信息素等的调控有关[86-87]。但目前有关环境激素对生殖行为的影响机制的研究，特别是对生物信息素的影响研究较少。

3.4 对子代的影响

有机锡污染物会致染色体畸变、DNA损伤[88-89]，并且会通过在卵子中的累积直接传递给下一代，导致鱼类子代畸形、繁殖力下降等。Horie等[81]报道，TPT暴露导致青鳉(O.latipes)F0和F1代产卵数量、受精率及肝脏Vtg水平下降，并且相对于F0代，F1代在更低的浓度组出现上述反应，认为这是由于TPT从亲本到子代的累积传递所致。但该研究在1.0～3.2 μg/L的暴露浓度范围内没有观察到性腺组织学方面的异常。Zhang等[90]在更低的暴露浓度下(1.6～1 000.0 ng/L)对青鳉亲本进行TPT暴露5周后，亲本Vtg基因表达下调，导致卵黄累积不足，卵子质量下降，子代出现胚胎发育期间血管出血、眼部畸形或无眼、脊柱弯曲以及连体、卵巢中成熟卵母细胞数量减少以及卵泡锁闭等现象，并且在暴露结束后在卵子中检测到TPT，说明TPT会通过母体向子代传递。吴鹏等[79]对孔雀鱼(P.reticulata)的研究中也观察到TBT-Cl暴露会导致子代脊柱弯曲和卵黄囊肿发生率显著提高现象。

4 展望

为保护生态环境与资源，确保食品安全和人类健康，笔者认为，今后应在以下4个方面加强研究：(1)结合地区气候特点和污染现状，加强环境激素的环境行为和不同环境激素之间相互作用的相关研究，更好地将实验室研究成果应用于环境和资源保护；(2)养殖鱼类直接关乎人体健康，我国养殖鱼类种类繁多，相应的养殖模式也多样化。针对养殖鱼类，结合养殖环境开展的相关研究尤显不足，应当加强；(3)新型化合物、药物等不断加速面世，带来了更多潜在的健康和环境风险，应加速开展针对新型化合物的环境行为和毒理效应等相关研究；(4)应注重综合生态学、生物学、化学等相关学科的最新研究成果，开发新的研究技术和设备，推进环境激素研究不断深入。