高寒草甸不同斑块草地土壤微生物多样性特征研究

王占青, 张杰雪, 杨雪莲, 黄 霞， 陈斯亮， 乔有明

(1. 青海大学生态环境工程学院， 青海 西宁 810016； 2. 青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016；3. 青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室， 青海 西宁 810016)

高寒草甸类草地是青海省分布面积最大、分布区域最广的草地类型，具有重要的生态价值和放牧利用价值[1]。在全球气候变化及人为因素干扰的影响下，高寒草甸呈退化态势，草地生产力和质量下降，退化草地面积增加，影响区域生态环境和经济社会可持续发展[2-3]。高寒草甸的退化首先表现为群落种类组成发生变化，以嵩草属(Kobresia)植物为优势的群落逐渐被以家畜不采食的杂类草为优势的群落所取代，进一步出现裸斑和土壤侵蚀。过度放牧降低了优良牧草的竞争优势，造成草地退化严重，进而阻碍了当地畜牧业的发展[4]。土壤微生物群落结构和组成变化主要受土壤特性和植被特性的影响，且土壤特性对土壤微生物的影响最大，草地退化过程中土壤养分有效性、植物群落组成和植物生物量的变化，影响原有的土壤微环境，将不可避免地改变土壤微生物群落的组成和多样性，逐渐形成了与新土壤微环境相适应的土壤微生物群落结构[5]。与此同时，新的微生物群落对其生存的土壤环境进行反向作用，进而使植被和土壤性状发生变化。因此，土壤微生物与其所处的植物和土壤性质有密切的关系[6-7]。

由于土壤微生物在全球生态系统中的重要性，土壤生物多样性特征研究现在已经成为一个热点，国内外学者们已经做了大量的研究[8-9]，但土壤微生物对草地退化的响应尚未得到充分研究。就高寒草甸而言，有研究认为退化斑块的形成和扩展是高寒草甸退化的关键特征，土壤微生物在指示退化草地方面发挥关键作用[10-11]，Che等[12]对高寒草甸的研究认为，退化斑块的形成显著改变了高寒草甸土壤微生物群落组成，明显降低了微生物呼吸活性，改变了微生物群落组成。事实上，高寒草甸退化过程中形成的斑块有不同的表现形式，代表了高寒草甸的不同退化阶段，既有因土壤-牧草间的养分供应失调和生理干旱造成草毡层死亡而形成的退化斑块，也有过度放牧导致的以杂类草为优势种的退化斑块，还有几乎无植物生长的极度退化裸斑[13]，故退化斑块是一个比较笼统的叫法。另外，因植物群落组成和土壤特性的空间异质性，在较大范围内推定退化梯度存在不足，对分布在不同地理位置高寒草地斑块研究可能导致研究结果的不一致。所以，明确研究对象具体属于何种退化斑块类型，并把研究对象选定在一个相对小的范围内，更具有实际意义。

本文以青海省泽库县境内的贵南县飞地为研究样地，该飞地曾经是军马场，是优良的草场。军马场撤离之后，该地一度作为公共放牧地，由于草场使用权归属问题和监管不到位，导致该地过度放牧，进而使该地区的优质天然草地逐步向家畜不采食的退化型草地演化，出现了以甘肃马先蒿(Pediculariskansuensis)、黄帚橐吾(Ligulariavirgaurea)和细叶亚菊(Ajaniatenuifolia)等为优势种的退化高寒草甸代表性植物群落。研究选取了矮嵩草高寒草甸及3个退化斑块群落土壤为研究对象，调查了土壤微生物群落结构功能及多样性，分析了异同，以验证高寒草甸地区土壤微生物是否因植物群落和土壤性质的变化发生了显著的改变。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于青海省泽库县境内的贵南县飞地，研究选取了以矮嵩草为优势种的典型高寒草甸和以细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿为优势种的退化草地斑块，具体信息详见表1。

表1 各采样地点状况

1.2 土样采集

2020年8月份用不锈钢土钻取样器采集各采样点表土层15 cm土壤，采样前3天未下雨。每一类型选取3个斑块(样点)，斑块间隔20 m以上，每次采样前后用酒精消毒并用滤纸将土钻清理干净，以防样品相互混入和污染，每个斑块内按梅花形在5个点上采集根区(root zone)土样[14]，放在塑料布上，充分混合(图1)。微生物分析每个样品5 g左右装入无菌管中，放入—4℃的便携式冰箱中，带回实验室保存于—80℃的冰箱中；理化性质每个样品1 kg左右，装入密封袋内封好，注明标号，将采集的土样带回实验室，部分用于测定水分，部分风干过筛后进行土壤养分的测定。

图1 采样示意图

1.3 土壤养分分析

土壤养分测定均采用常规分析方法，具体测定步骤参照鲍士旦《土壤农化分析(第三版)》[15]。其中，测定项目包括土壤水分含量(烘干称重法)，土壤酸碱度(PHS-3E)，有机质含量(重铬酸钾稀释热法)，铵态氮含量(流动注射法)，硝态氮含量(间隔流动分析法)，速效磷含量(0.5 mol·L-1NaHCO3浸提法)和速效钾含量(NH4OAc浸提)。

1.4 土壤微生物群落测定与分析

取出超低温条件保存的土壤微生物无菌管样品，并放置在装有干冰的泡沫箱中寄送至北京诺禾致源公司进行测序分析。采用Illumina Hi Seq2500平台分别对细菌16S rRNA和真菌ITS基因的V3-V4区序列和ITS2区序列进行高通量测序，进行α多样性分析，包括群落丰富度指数和香农指数分析[16]。采用Faprotax(Functional Annotation of Prokaryotic Taxa)进行土壤细菌群落生态功能预测，利用FUNGuild进行土壤真菌功能注释分析。

1.5 数据分析

土壤养分数据采用SPSS 20.0进行整理以及相关性和单因素方差分析(One-way ANOVA)，处理间差异显著性比较采用最小显著性差异法(LSD)，土壤微生物数据采用R3.6.1语言相关软件包处理。

2 结果与分析

2.1 不同斑块草地土壤养分变化分析

不同群落类型草地土壤养分数据及统计结果显示(表2)，土壤pH介于7.97～8.61之间，呈弱碱性，属于高寒草甸土壤的正常酸碱度范围[17]。相比于较为完整的矮嵩草草甸，退化斑块的土壤有机质、速效钾、速效氮、铵态氮和硝态氮含量显著降低(P<0.05)，其中，有机质和速效氮含量下降幅度均超过50%以上；几种类型草地土壤速效钾含量介于71.50～199.17 mg·kg-1之间，其中甘肃马先蒿斑块的土壤速效钾含量不到矮嵩草草甸的40%；细叶亚菊和黄帚橐吾两种斑块的土壤速效磷含量约占矮嵩草草甸的50%，但甘肃马先蒿斑块速效磷含量显著高于矮嵩草草甸，其含量值是矮嵩草草甸的6.97倍，这可能是土壤速效磷本底值比较高。退化斑块的土壤水分也显著低于矮嵩草草甸，细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿斑块的土壤水分含量分别比矮嵩草草甸土壤下降了29.36%，44.37%和44.14%。

表2 不同斑块草地土壤养分

2.2 不同斑块草地土壤微生物群落比较

2.2.1微生物OTU数目分析 操作分类单元(Operational taxonomic units，OTU)聚类分析表明：不同斑块群落间共同拥有土壤真菌OTU为413个。其中，矮嵩草草甸土壤非共有的真菌OTU数最多，甘肃马先蒿斑块最少，4种类型真菌OTU平均差异为444个(图2a)。不同斑块群落土壤细菌共有的OTU是1 554个，细叶亚菊斑块土壤非共有的细菌OTU数最多，甘肃马先蒿斑块最少，4种类型细菌OTU平均差异为605个(图2b)。

图2 不同斑块草地土壤微生物共有和特有的OTU数

2.2.2微生物群落组成及结构变化分析 真菌分析共检测出16个门，59个纲，147个目，324个科，569个属，874个种。分析结果显示(表3)，土壤真菌群落均以子囊菌门(Ascomycota)最具优势，其相对丰度在KH，AT，LV和PK中的比分别为61.71%，61.49%，40.95%和66.79%，平均占比约为57.74%；其它优势类群为担子菌门(Basidiomycota)(4.77% ～34.46%)和被孢霉门(Mortierellomycota)(3.92%～11.17%)，而根肿黑粉菌门(Entorrhizomycota)几乎未出现在黄帚橐吾和甘肃马先蒿斑块群落土壤中。在种水平上，古根菌(Archaeorhizomycessp.)在矮嵩草草甸中的占比明显高于其他斑块，湿伞菌(Hygrocybesp.)主要出现在黄帚橐吾斑块中；内生真菌枝孢菌(Cladosporiumsp.)和球孢白僵菌(Beauveriabassiana)主要出现在甘肃马先蒿斑块中；Stagonosporopsiscucurbitacearum在细叶亚菊斑块中占比最高。

表3 不同斑块草地土壤微生物在门和种水平上的丰度变化

细菌分析共检测出71个门，128个纲，278个目，381个科，706个属，259个种。AT，LV和PK群落土壤优势类群为变形菌门(25.05%～33.82%)，KH群落土壤优势类群为放线菌门(28.28%)；其他类群为厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、绿弯菌门(Chloroflexi)、粘球菌门(Myxococcota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)和蓝藻门(Cyanobacteria)，约占到了所有细菌的22.82%，还有约15.37%未鉴定到门水平的细菌。在种水平上，Romboutsiaileali主要出现在黄帚橐吾斑块中，鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus)主要出现在甘肃马先蒿斑块中，而Bacilluscellulasensis和大肠杆菌(Escherichiacoli)几乎未在甘肃马先蒿斑块土壤中出现。

2.3 不同斑块草地土壤微生物多样性分析

2.3.1微生物物种多样性分析 土壤微生物多样性结果显示：不同斑块草地间土壤真菌Chao1指数和Shannon指数均无显著差异(表4)，表现为细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿斑块土壤真菌的Chao1指数和Shannon指数均高于矮嵩草草甸。土壤细菌Chao1指数和Shannon指数均以细叶亚菊斑块最高，均显著高于甘肃马先蒿斑块和矮嵩草草甸(P<0.05)。

表4 不同斑块草地土壤群落α多样性

2.3.2微生物生态功能多样性分析 利用FUNGuild对不同斑块草地土壤真菌进行功能注释(如图3a)，腐生营养型(Saprotroph)真菌在KH，AT，LV和PK中的相对丰度分别为52.18%，23.57%，28.69%和19.00%，KH与其他类型间差异显著(P<0.05)(表5)；病理营养型(Pathotroph)真菌相对丰度分别为3.02%，22.35%，2.93%和20.13%，KH与AT，PK间差异显著(P<0.05)；共生营养型(Symbiotroph)真菌相对丰度分别为0.84%，1.44%，2.24%和5.27%，PK与其他类型间差异显著(P<0.05)。腐生营养型真菌在矮嵩草草甸土壤中占比高，病理营养型及病理-腐生过渡型真菌在细叶亚菊斑块土壤中较丰富；病理/病原-腐生-共生过渡型及腐生-共生过渡型真菌在黄帚橐吾斑块土壤中较丰富；病理-共生过渡型及共生营养型真菌相对丰度在甘肃马先蒿斑块中显著高于其它斑块(P<0.05)。

表5 不同斑块草地土壤功能微生物丰度变化

采用Faprotax对不同斑块草地土壤细菌群落功能进行预测(如图3b)，细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿斑块的烃类降解菌(Hydrocarbon_degradation)和芳烃降解菌(Aromatic_hydrocarbon_degradation)的丰度比矮嵩草草甸低，各类型间差异不显著；化能异养(Chemoheterotrophy)和叶绿体(Chloroplasts)细菌的相对丰度在甘肃马先蒿斑块中最高，且与其他类型间差异显著(P<0.05)；硝酸盐/亚硝酸盐呼吸(Nitrate_respiration/Nitrite_respiration)、氮呼吸(Nitrogen_respiration)、亚硝酸铵化(Nitrite_ammonification)、几丁质分解菌(Chitinolysis)、人类病原菌(Human_pathogens_all)和延胡索酸呼吸菌(Fumarate_respiration)等为优势功能菌群的相对丰度在黄帚橐吾斑块中最高，各类型间差异不显著；甲醇氧化(Methanol_oxidation)、甲基化(Methylotrophy)、亚硝酸盐反硝化/反硝化(脱氮Nitrite_denitrification/denitrification)和暗氢氧化(Dark_hydrogen_oxidation)等为优势功能菌群的相对丰度在细叶亚菊斑块中最高，且与其他类型间差异显著(P<0.05)。

2.4 不同斑块草地微生物与土壤养分的相关性分析

相关性分析结果表明(表6)，土壤真菌群落担子菌门的相对丰度与有机质、速效钾、速效氮和铵态氮之间极显著正相关，而与pH之间显著负相关(P<0.01)。另外，根肿黑粉菌门的相对丰度与水分、硝态氮之间显著正相关(P<0.05)；捕虫霉门与pH之间显著正相关(P<0.05)，罗兹菌门与速效磷之间显著负相关(P<0.05)。土壤pH、有机质、速效钾、速效氮、铵态氮、硝态氮和水分对真菌群落的相关性较大，而速效磷对土壤真菌群落的相关性较小。

表6 土壤微生物群落结构与土壤养分的相关性分析

土壤细菌群落与土壤pH、有机质、速效钾、速效氮、速效磷、铵态氮、硝态氮和水分相关性较大。其中，细菌群落拟杆菌门、蓝藻门和芽单胞菌门的相对丰度与pH之间显著正相关(P<0.01)；变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门和芽单胞菌门的相对丰度与有机质、速效钾、速效氮、铵态氮和硝态氮之间极显著负相关(P<0.01)，与pH之间极显著正相关；放线菌门与有机质、速效钾、速效氮、铵态氮和硝态氮之间极显著正相关(P<0.01)。结果表明：土壤有机质、速效钾、速效氮、硝态氮、铵态氮能够显著影响高寒草地不同斑块草地土壤细菌群落的分布(P<0.01)，土壤养分对细菌群落的影响比对真菌群落的影响更为显著。

3 讨论

3.1 不同斑块草地土壤养分的差异

土壤环境是陆地植物赖以生存的物质基础，是生态系统中物质和能量交换的重要场所。土壤养分改变会影响到植物的生长和发育，而植物的生长又可以改变土壤养分[18-19]。植被退化与土壤退化是草地退化的2个层面，植被退化是高寒草地土壤退化的直接原因，而土壤退化也必然会引起地上植被退化，二者互为因果。高寒草甸退化斑块的形成过程中，会在地表形成较大的地空斑，地下形成较多的根空斑，这为不可食的杂类草入侵创造了良好的空间和条件，同时显著降低高寒草甸生态系统的土壤养分[20]。本研究发现，草地退化斑块的形成使pH有所增加、土壤持水能力减弱、土壤营养成分下降，这与刘育红[21]等人的研究结果一致。土壤有机质和速效钾等其它养分含量因斑块化而导致的优势种植物种类和土壤条件不同而具有显著差异性，造成这种结果差异性的主要原因可能是草地退化斑块间生境的异质性及植物种间生物学与生态学特征的差异。以黄帚橐吾为优势种的群落土壤有机质、速效钾、速效氮、铵态氮、硝态氮含量仅次于矮嵩草高寒草甸，表明这种类型斑块存在的地方土壤养分尚未发生剧烈的损失；所有养分指标值在甘肃马先蒿草地中含量最低，表明甘肃马先蒿可在养分条件相对较差的地方生长，但速效磷含量最高可能是土壤磷本底值比较高的原因。诸多学者[22-23]研究了不同退化程度高寒草甸退化对土壤物理化学性质的影响，均表明草地退化演替的进行使得土壤营养物质流失较大，土壤趋向贫瘠化。本研究的结果也再次印证当以矮嵩草为优势植物的高寒草甸群落变为以细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿为优势的群落或斑块时，土壤养分指标值会显著下降，一是因为这些杂类草比嵩草生长旺盛，消耗更多的养分和水分；二是因为不可食杂类草斑生长的地方原生草皮层已破坏或不存在，冬春季有不同程度的土壤侵蚀，长期如此，导致土壤养分含量降低。

3.2 不同斑块草地土壤微生物群落的差异

植物的生长与微生物密切相关，植物种类是决定土壤微生物群落结构的主要因子之一，植物不仅可以为土壤微生物提供生存所必需的物质和能量[24]，还可以直接影响土壤微生物群落多样性和结构功能的动态变化[25]。高寒草甸地区不论草甸退化与否，子囊菌门真菌均占有较大的优势，这与前人在高寒天然草甸和人工草地的研究结果相一致[26-27]。在种水平上，古根菌、湿伞菌、内生真菌枝孢菌、球孢白僵菌和Stagonosporopsiscucurbitacearum在不同群落所占比例差异或出现与否则反映出群落优势植物发生显著变化后，真菌种类表现出的主要差异。矮嵩草草甸细菌优势类群为放线菌门，其它类型细菌优势类群均为变形菌门，这与刘怡萱等人[28]的研究结果一致。在种水平上，Romboutsiailealis在黄帚橐吾斑块,鼠乳杆菌和约氏乳杆菌两种细菌在甘肃马先蒿斑块中占比较高，而Bacilluscellulasensis和大肠杆菌几乎不出现在甘肃马先蒿为优势的群落中，这些均反映了群落优势植物发生显著变化后，细菌种类表现出的主要异同。本研究的矮嵩草草甸、细叶亚菊斑块、黄帚橐吾斑块和甘肃马先蒿斑块间土壤真菌丰富度指数和多样性指数均无显著差异，这一结论与艾泽民[29]的研究结果相似，而与姚玉娇等[30]的研究结果相反，归因于不同研究者对退化阶段的确定以及不同斑块类型的差异。很多研究认为草地退化后土壤细菌数量呈增加趋势[31]，但马源等[32]认为随着退化程度的加剧，土壤细菌数量呈逐渐降低的趋势。本研究的结果表明，当矮嵩草草甸的优势植物被细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿等取代后，土壤细菌的丰富度和多样性因优势植物或土壤养分的不同表现出了显著差异，细叶亚菊和黄帚橐吾斑块土壤细菌丰富度指数和香农指数显著高于矮嵩草草甸，但甘肃马先蒿斑块土壤细菌丰富度指数低于矮嵩草草甸，这可能与其所处土壤的贫瘠化相关。

土壤真菌营养类型的分化与优势植物种类和土壤养分含量显著不同密切关联。本研究中矮嵩草草甸土壤养分含量最高，土壤真菌营养类型主要为腐生营养型真菌；甘肃马先蒿斑块土壤养分含量最低，土壤真菌营养类型主要为病理-共生过渡型及共生营养型真菌；细叶亚菊和黄帚橐吾斑块土壤真菌营养类型则分别以病理营养型、病理-腐生过渡型真菌和病理/病原-腐生-共生过渡型及腐生-共生过渡型真菌为主。尹亚丽[33]研究认为轻度退化草地病理营养型真菌丰度增加，而腐生营养型及共生营养型真菌丰度降低，本研究部分结果与之相似。不同斑块草地土壤细菌群落功能群分布也有明显的差别，矮嵩草草甸土壤细菌群落主要以烃类降解细菌和芳烃降解细菌为主；甘肃马先蒿斑块土壤细菌群落以化能异养和叶绿体细菌为主；细叶亚菊和黄帚橐吾斑块土壤具有较多类型的优势细菌功能群存在。总的来说，不同优势植物的草地斑块具有显著不同的土壤细菌群落结构和功能性微生物，最直接的原因是植物种类和土壤养分变化，但如植物根际分泌物、微生物间的相互作用等深层次的原因还需要进一步探讨。

3.3 草地土壤养分与土壤微生物间的相关性分析

草地土壤真菌和细菌与养分的相关性有所不同。土壤养分主要影响真菌群落中担子菌门，而对其他真菌没有显著影响。另外，除罗兹菌门与土壤速效磷负相关外，土壤有机质、速效钾、速效氮、铵态氮和担子菌门均呈现极显著正相关。细菌群落中变形菌门、拟杆菌门、蓝藻门和芽单胞菌门的相对丰度与土壤有机质、速效钾、速效氮、铵态氮之间极显著负相关；放线菌门与有机质、速效钾、速效氮和铵态氮之间极显著正相关；硝态氮含量和土壤细菌及多数真菌不存在显著的相关关系。张杰雪等[26]研究表明土壤理化性质对高寒地区人工草地细菌菌属影响较小，而对真菌菌属影响较大，本研究结果与之不一致，土壤养分对高寒草甸不同斑块细菌群落影响较大，而对真菌群落影响较小，反映出土壤微生物对人工草地和天然草甸的不同响应。土壤pH和水分含量与微生物的相关性与养分的情况类似，受其影响的真菌门少，受影响的细菌门多，这可能与土壤真菌能够适应偏酸环境，而细菌适应偏碱环境有一定关系。

4 结论

以矮嵩草为优势植物的高寒草甸群落变为以细叶亚菊、黄帚橐吾和甘肃马先蒿为优势的群落或斑块后，土壤养分含量显著下降，pH有增加的趋势。土壤真菌群落丰富度和多样性未因优势植物的明显变化而呈现出显著差异，但土壤细菌群落表现出了显著差异。土壤真菌营养类型的分化与优势植物种类和土壤养分含量显著不同密切关联，草地退化降低了腐生营养型真菌丰度，而共生营养型真菌丰度显著增加；不同优势植物草地斑块具有显著不同的土壤细菌群落结构和功能性微生物。与养分情况类似，土壤pH和水分含量与真菌相关性小，与细菌相关性大。