细胞因子在百草枯中毒致肺纤维化中的作用研究进展

孙阳阳，骆 媛，王永安

（1.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒物学国家重点实验室，北京 100850；2.96604部队医院药剂科，甘肃 兰州 730030）

百草枯（paraquat，PQ）是一种使用广泛的速杀性除草剂，有很强毒性。PQ中毒主要损伤肺组织，早期引起肺泡炎、肺水肿和肺出血等，肺纤维化是PQ致死的主要原因［1-2］。由于PQ化学结构与内源性聚胺类似，经消化道摄入体内后，被肺泡上皮细胞通过主动转运方式摄入并蓄积，中毒后30 h肺PQ浓度可达血液循环中的数倍。PQ在细胞色素P450酶等作用下产生大量活性氧及活性氮，引起氧化应激和脂质过氧化，进而导致线粒体损伤和细胞内氧化还原失衡，进一步加剧氧化应激损伤；此外，也会导致NF-κB活化，继而诱导炎症相关酶、细胞因子和趋化因子的产生［3-4］。这些细胞因子在PQ所致的肺纤维化发展中发挥了关键作用，涉及肺上皮细胞损伤、肌成纤维细胞活化、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积等肺纤维化进展的关键过程。本文对细胞因子在PQ中毒所致肺纤维化中的作用以及基于细胞因子的靶向治疗策略进行综述，为发现PQ中毒治疗新靶点和特效解毒药物研发提供依据。

1 炎性细胞因子在百草枯所致肺纤维化中的作用

PQ所致肺纤维化的形成经历损伤-修复-再损伤-过度修复的复杂过程，损伤后的肺上皮细胞和巨噬细胞可介导各类炎症因子的释放，如白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-17和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）这些炎症因子可维持肺组织持续炎症，进而加剧肺组织损伤，此外这些炎症因子还可通过促进EMT和成纤维细胞分泌ECM促进肺纤维化。

1.1 白细胞介素6通过促进EMT加剧肺纤维化

EMT是多种疾病发生发展的基本过程，被认为参与了肺纤维化的发生发展过程，经EMT途径由上皮细胞转变的间充质细胞被认为是肌成纤维细胞的潜在来源之一。IL-6可通过IL-6/信号转导及转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路促进EMT的进展，加重肺纤维化［4］。研究发现，PQ中毒患者入院后24 h，3 d和7 d，其血清中IL-6持续高表达［5］；IL-6在PQ暴露的小鼠肺组织中也呈时间-剂量依赖性增加，并通过促进EMT加速肺纤维化进程［6］；此外，使用补体成分5a（complement component 5a，C5a）抗体阻断C5a活化可降低PQ所致小鼠肺纤维化组织中IL-6表达的增加，从而显著减轻肺组织病理损伤，减轻肺纤维化，维持肺泡隔结构的相对完整［7］。

1.2 白细胞介素17通过炎性反应促进肺纤维化

IL-17家族由6种结构相关的细胞因子IL-17A（IL-17），IL-17B，IL-17C，IL17D，IL-17E（IL-25）和IL-17F组成［8］。在肺纤维化小鼠模型中发现，CD4+和γδT细胞通过表达IL-17A可诱导中性粒细胞增加并引起肺纤维化，IL-17受体缺陷小鼠相比野生型小鼠表现出更轻的纤维化症状［9］。小鼠染毒PQ后，IL-17表达显著上调并通过活化NF-κB P56和募集中性粒细胞引起炎症“瀑布效应”进而加剧肺损伤，在通过腹腔注射中和抗体阻断IL-17A后，急性肺损伤明显减轻［10］；免疫调节剂维生素D也可显著降低PQ暴露7 d后小鼠肺泡灌洗液中IL-17的表达增加，减少肺组织中胶原沉积，减轻肺纤维化［11］。

1.3 肿瘤坏死因子α通过刺激炎症介质产生促进肺纤维化

TNF-α是巨噬细胞产生的重要细胞因子之一，是宿主防御中的重要成分，在各种损伤和刺激后均迅速释放［12］。研究证实，TNF-α在肺纤维化小鼠的肺组织中表达显著增加，且可通过NF-κB通路促进肺部静息间充质干细胞活化并转化为肌成纤维细胞；抑制TNF-α可显著减轻小鼠肺纤维化程度［13］。给予免疫调节剂FTY720治疗（每周2次，连续用药4周）后，在给药早期（第3天）即可显著降低PQ染毒小鼠支气管灌洗液中TNF-α和IL-6的表达；给药4周后可显著降低小鼠肺组织中ECM主要成分Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达，同时显著减轻小鼠肺纤维化［14］。

2 促肺纤维化细胞因子在百草枯所致肺纤维化中的作用

在肺纤维化发展过程中，多种促纤维化细胞因子对维持肺纤维化状态中至关重要，如转化生长因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）和低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）。其主要的作用机制包括调控成纤维细胞增殖、迁移和活化并促进其分泌大量ECM；此外，这些细胞因子还可促进肺上皮细胞凋亡和EMT。

2.1 转化生长因子 β通过诱导肌成纤维细胞转分化和上皮细胞EMT促进肺纤维化

静息的成纤维细胞活化为肌成纤维细胞并持续存在是肺纤维化的重要病理特征，此过程中成纤维细胞在一系列细胞因子作用下转变为肌成纤维细胞，从而使细胞中平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达增加，应力纤维形成，细胞迁移、收缩增强并产生大量ECM，最终形成肺纤维化［15］。在PQ中毒早期，巨噬细胞分泌的TGF-β促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞［16］；与肌成纤维细胞的活化高度相关的α-SMA蛋白高度表达，分化后的肌成纤维细胞开始大量分泌ECM，进一步加剧肺纤维化。已发现的TGF-β超家族有3种亚型（TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3），所有亚型均与 TGF-β2受体结合形成二聚体，此二聚体再募集并活化TGF-β1受体并进一步活化下游包括基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）等一系列受体信号通路引起组织纤维化［17］。研究表明，PQ中毒后，TGF-β在血清和肺组织中表达均显著升高，PQ可促进TGF-β1表达增加及其下游Smad2/3磷酸化从而激活TGF-β/Smad通路，并进一步引起EMT 和纤连蛋白分泌［18］。TGF-β1特异性抑制剂SB431542可阻断PQ引起的A549细胞EMT产生，降低α-SMA蛋白的表达，同时也抑制了A549细胞的迁移［19］。

2.2 结缔组织生长因子通过诱导成纤维细胞活化和ECM分泌促进肺纤维化

CTGF是一种参与细胞增殖、血管生成、肿瘤发展和组织纤维化等病理生理过程的细胞因子。肺组织中静息的成纤维细胞很少表达CTGF，但CTGF在TGF-β或其他细胞因子介导的肺纤维化组织及肺成纤维细胞中高表达，CTGF可被TGF-β信号通路直接诱导过表达进而促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，并获得纤维化表型［20］。Tung等［21］发现，在人肺成纤维细胞中，PQ可通过激活血管紧张素通路增加CTGF的表达并促进人肺成纤维细胞（MRC-5）分泌更多的胶原蛋白。暴露于PQ的MRC-5 CTGF表达显著增加；使用CTGF刺激MRC-5可促进其增殖、迁移并向肌成纤维细胞分化，同时α-SMA蛋白和胶原蛋白表达显著上调［22］。将使用小干扰 RNA（small interference RNA，siRNA）沉默CTGF后的MRC-5细胞暴露PQ后，金属蛋白酶组织抑制因子2（tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）、MMP-2和MMP-9等肺纤维化标志物表达显著下降，MRC-5细胞增殖和迁移能力亦受到抑制［23］。苏等［24］研究发现，大鼠PQ中毒2周后，出现肺泡壁明显增厚、间充质细胞增多呈成纤维细胞样外观、胶原沉积呈斑片状分布等肺纤维化症状，并伴有CTGF表达显著升高；使用慢病毒介导短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）干扰PQ染毒大鼠肺组织CTGF的表达后，大鼠呼吸系统症状和肺病理损伤明显改善。

2.3 血管内皮生长因子通过刺激成纤维细胞转分化和ECM分泌促进肺纤维化

VEGF是一类具有促进血管通透性增加、ECM变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等生理功能的超家族［25］。VEGF是最有效的血管生成刺激因子之一，肺组织中VEGF过表达会使肺血管通透性增加而导致肺水肿。体外研究发现，VEGF特定亚型VEGF165a可直接刺激成纤维细胞分化并表达更多纤连蛋白［26］。在VEGF超家族中，VEGF-A被认为与肺纤维化发展密切相关［27］。体内研究发现，PQ染毒大鼠21 d后，肺组织中VEGF-A表达显著增加，同时肺纤维化标志物TIMP-1、Ⅰ型胶原蛋白、MMP-1和TGF-β等表达也显著增加，Masson染色显示出现明显纤维化［28］。

2.4 血小板衍生生长因子通过激动成纤维细胞增殖和ECM分泌促进肺纤维化

PDGF可促进成纤维细胞的有丝分裂、增殖和分化，并引起ECM沉积［29］，从而参与纤维化发生机制。黄敏等［30］报道大鼠染毒PQ后，从第7天开始PDGF表达逐渐升高，第27天时达到峰值，并且随着PDGF的表达增高，肺组织中的胶原纤维增生也逐渐加重。此外，体内外研究均证实，PDGF受体抑制剂可明显抑制肺上皮细胞凋亡，减轻肺成纤维细胞增殖和肺纤维化。尼达尼布（Nintedanib）是一种酪氨酸激酶抑制剂，可同时抑制PDGF受体、成纤维细胞生长因子受体和VEGF受体，从而阻断成纤维细胞的增殖、迁移和分化以及ECM的分泌等纤维化过程。此外，尼达尼布在肺纤维化动物模型中同样表现出显著的抗纤维化和抗炎活性［31］。

2.5 低氧诱导因子-1 α通过糖酵解重编程促进肺纤维化

研究发现，肺纤维化模型小鼠HIF-1α/丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）介导的糖酵解重编程是一种关键的代谢改变，可促进成纤维细胞的分化和纤维化进程［32］。大鼠暴露PQ 2 h后，肺组织中HIF-1α表达显著增加，大鼠呈肺纤维化表现［33］；A549细胞暴露PQ后HIF-1α表达亦显著增加，细胞EMT标志性蛋白α-SMA表达也增加，将HIF-1α基因沉默后，PQ暴露的细胞EMT程度减轻［32］。进一步研究发现，HIF-1α可通过Snail和β-连环蛋白（catenin）通路促进PQ诱导的大鼠肺纤维化［34］，阿托伐他汀可通过下调HIF-1α/β-连锁蛋白通路在体内、外降低EMT标志性蛋白α-SMA和波形蛋白（vimentin）的表达，从而减轻PQ引起的EMT和肺纤维化［35］。

3 抗纤维化细胞因子在百草枯所致肺纤维化中的作用

肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、脂联素（adiponectin，APN）、褪黑素和成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor21，FGF21）等内源性抗纤维化细胞因子，可对抗炎性细胞因子和促纤维化细胞因子介导的纤维化效应。这些细胞因子可通过抑制氧化应激减轻肺上皮细胞的损伤和EMT，此外，还可通过拮抗成纤维细胞的活化、减少ECM的分泌抑制肺纤维化。一些抗纤维化细胞因子还可直接减少促纤维化细胞因子的产生，发挥间接抑制肺纤维化的作用。

3.1 肝细胞生长因子调节成纤维细胞凋亡和降解ECM抑制肺纤维化

HGF是一种作用于上皮细胞、造血细胞和血管内皮细胞等多种细胞，可调节细胞生长、运动和形态发生的多功能因子。在肺组织中HGF可通过诱导肺上皮和内皮细胞的存活和增殖，以及减少肌成纤维细胞的累积从而抑制肺纤维化［36］。小鼠肺纤维化模型中给予外源性HGF可通过增加肺组织中MMP活性以降解肌成纤维细胞分泌的ECM，促进肌成纤维细胞凋亡，从而显著缓解肺纤维化，提示HGF可能是治疗肺纤维化的潜在靶点［37］。通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞，可显著增强PQ染毒大鼠肺组织中HGF表达和降低TGF-β1的表达，减轻大鼠肺纤维化［38］。

3.2 脂连蛋白通过降低氧化应激抑制肺纤维化

APN是一种脂肪细胞来源的蛋白，由一个30 ku的单体蛋白经翻译后修饰成不同的多聚体，并分泌到循环中。APN具有多种生物学特性，与脂连素受体1和脂连素受体2结合后，可发挥抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、抗炎活性以及细胞保护作用，已证明APN可降低VEGF表达［39］。He等［40］报道，A549细胞暴露于PQ 24 h后再给予APN可明显逆转PQ引起的细胞损伤和线粒体功能紊乱，APN通过激活腺苷酸活化蛋白激酶〔adenosine 5′-mono-phosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK〕通路降低PQ引起的氧化应激损伤。研究发现，APN可有效降低PQ染毒小鼠肺组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量等氧化应激产物，减轻炎症细胞的浸润［41］；此外，小鼠PQ染毒后0，24和48 h给予APN，可剂量依赖性降低肺组织中TGF-β1，CTGF和α-SMA及外周循环中MMP-9和TIMP-1的表达，减轻肺纤维化。体外实验亦证实，APN可降低肺成纤维细胞Ⅲ型胶原蛋白的表达，从而减轻PQ引起的肺纤维化［42］。

3.3 褪黑素通过降低氧化应激、炎症因子及促纤维化因子表达水平抑制肺纤维化

褪黑素是一种有效的抗氧化剂，可诱导抗氧化酶表达，清除自由基，调节细胞凋亡和自噬途径［43］。研究发现，褪黑素能显著降低PQ染毒大鼠血清MDA含量，增加SOD和过氧化物酶等抗氧化酶的活性，降低PQ引起氧化应激和脂质过氧化损伤；此外，褪黑素还可降低PQ染毒大鼠血清中NF-κB活化，降低TGF-β，TNF-α和IL-6水平［44］。在体外实验中，负载褪黑素的纳米胶囊可降低PQ中毒所引起的DNA损伤，降低PQ诱导的A549细胞毒性［45］。

3.4 成纤维细胞生长因子21通过减少氧化应激及促纤维化因子抑制肺纤维化

FGF21可调控能量平衡和胰岛素敏感性，还可通过转录激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）参与氧化应激调节［46］。小鼠腹腔注射FGF21抑制NF-κB促炎通路，减少促纤维化分子纤溶酶原激活物抑制剂1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）和TGF-β的表达。FGF21可显著减少PQ染毒A549细胞的TGF-β、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达，降低肺纤维化小鼠肺组织内胶原沉积、降低MDA水平和炎性细胞的浸润［47］。

综上所述，PQ中毒导致肺损伤进而释放大量细胞因子，其中炎症细胞因子和促纤维化细胞因子可加剧肺纤维化。此外，一些抗纤维化细胞因子却能抑制肺纤维化。这些细胞因子之间的失衡和表达差异导致肺纤维化。

4 百草枯致纤维化的细胞因子靶向治疗策略

细胞因子和细胞间信号转导在PQ致肺纤维化中发挥了重要作用，其阻断剂可在一定程度上减轻PQ中毒引起的肺纤维化。因此，基于炎症细胞因子和促肺纤维化细胞因子的拮抗或阻断药物可能会成为靶向治疗PQ致纤维化的新策略。

图1 细胞因子参与百草枯中毒致肺纤维化过程.IL-6：白细胞介素6；IL-17：白细胞介素17；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；TGF-β：转化生长因子β；VEGF：血管内皮生长因子；CTGF：结缔组织生长因子；PDGF：血小板衍生生长因子；HIF-1α：低氧诱导因子1α；HGF：肝细胞生长因子；APN：脂联素；FGF21：成纤维细胞生长因子21.

4.1 抑制炎症细胞因子

研究发现，糖皮质激素可通过直接抑制NF-κB表达降低其下游其他炎性细胞因子水平，还可通过下调STAT等基因来减少干扰素，IL-5和IL-6等炎症因子的表达［48］。环磷酰胺是一种有效的免疫抑制剂，可显著减轻自身免疫性疾病症状和炎症反应。单用环磷酰胺（15 mg·kg-1）可显著降低PQ中毒大鼠血清中TGF-β1水平，减轻肺损伤，降低中毒大鼠死亡率［49］。临床使用糖皮质激素联合环磷酰胺治疗PQ中毒效果更好，患者生存率可达75%［50］，因此在标准治疗的基础上，糖皮质激素联合环磷酰胺已成为目前临床上常用救治PQ中毒及其引起的肺纤维化的有效策略［51］。然而，一项随机临床试验表明，高剂量免疫抑制治疗方案（静脉注射环磷酰胺1 g·d-1，给药2 d；甲泼尼龙1 g·d-1，给药3 d；然后口服地塞米松8 mg，3 d-1，给药14 d）相对安慰剂组并未明显改善患者死亡率，但该试验证实持续2周口服地塞米松可使PQ中毒患者生存率有所提高。由此提示糖皮质激素联合环磷酰胺治疗PQ中毒在临床应用中还需权衡利弊。

4.2 抑制促纤维化细胞因子

目前，已批准上市用于治疗肺纤维化的药物吡非尼酮和尼达尼布等均具有抗促纤维化细胞因子作用。吡非尼酮具有抗炎、抗氧化应激和抗纤维化作用［52］。一项吡非尼酮联合泼尼松龙治疗PQ引起的肺纤维化临床试验发现，单用吡非尼酮即可降低肺组织中羟脯氨酸（胶原组织的主要成分之一）含量，抑制TGF-β1和 TNF-α表达，减轻肺纤维化［53］。PQ中毒大鼠连续雾化吸入吡非尼酮14 d的抗纤维化作用优于经胃给药［54］。在多项自发性纤维化临床试验研究中发现，酪氨酸激酶抑制剂尼达尼布可阻断血小板源性生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）、血管内皮生长因子受体1-3和成纤维细胞生长因子受体1-3，从而改善自发性肺纤维化患者肺功能，减轻肺纤维化［55］。研究发现，尼达尼布可有效降低PQ染毒老年小鼠血清中的TNF-α和IL-6水平，减轻肺纤维化及肺炎症浸润程度，其作用机制可能与PDGFR/蛋白激酶B/胞外信号调节激酶信号通路介导的抗炎症和抗凋亡作用有关［56］。然而，尼达尼布用于治疗PQ所致肺纤维化的临床试验鲜有报道，其临床治疗效果还需进一步观察。

4.3 应用抗纤维化细胞因子

通过给予PQ中毒动物模型应用抗纤维化细胞因子，表现出良好的对抗PQ毒性的效果；PQ中毒大鼠给予促肝细胞生长因子干预后，其MDA含量、NF-κB和TGF-β1表达量均显著降低，SOD和GSH-Px活力性增加［57］。褪黑素同样在多种动物模型中表现出拮抗PQ引起的氧化应激、脂质过氧化、细胞凋亡等损伤的效应［58-59］。其治疗效果还需进一步验证。

此外，一些中药也表现出对PQ所致肺纤维化的治疗作用。使用血必净静脉注射联合常规治疗可有效降低患者血清中的TGF-β和Ⅲ型胶原蛋白水平，显著降低患者死亡率［60-61］。大株红景天注射液结合常规对症治疗PQ中毒患者，可显著降低患者肺纤维化发生率，降低患者死亡率、延长存活时间、缩短住院时间［62］。此外，刺檗和甜菜根提取物在动物实验中也表现出对抗PQ所致肺损伤和肺纤维化的潜在作用［63］，但临床效果仍需进一步验证。

5 结语

PQ致肺纤维化损伤过程异常复杂，涉及氧化应激、炎症反应、成纤维细胞活化和ECM分泌等过程，在上述过程中均有炎性细胞因子、促纤维化细胞因子、抗纤维化细胞因子调控及参与，这些细胞因子对肺纤维化的发展及转归的调节涉及TGF-β、Wnt、Snail和β连环素等通路。众多细胞因子在PQ致肺纤维化过程中相互作用，构成一个复杂的细胞因子网络，其机制尚未完全阐明，目前也尚未发现PQ中毒特效解毒药物。但多项体内外研究结果表明，通过拮抗促纤维化细胞因子和炎症细胞因子的治疗以及补充抗纤维化细胞因子的治疗，均可抑制炎症细胞浸润、延缓肺纤维化进展，尤其多项实验证实抗肺纤维化药物吡非尼酮可降低PQ中毒小鼠肺组织中TNF-α和TGF-β1表达，减少肺组织中ECM的沉积，抑制肺纤维化，延长中毒小鼠存活时间［53，64］，提示基于细胞因子的靶向治疗可能在抑制PQ中毒早期肺间充质纤维化发生、减轻PQ中毒症状中发挥重要作用，为临床PQ中毒救治提供新策略。