一氧化氮供体JS-K通过蛋白磷酸酶2A调控磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

徐静蕾，胡伊乐，杨佳文，朱心雨，李 静，霍梦惠，刘 玲

（河南科技大学基础医学院，河南 洛阳 471003）

肝癌是一种最常见的致命性恶性肿瘤，发现时往往已经是晚期癌［1］。在所有肝癌病例中，超过90%是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma cells，HCC），目前化学疗法和免疫疗法是治疗的最佳选择，当肿瘤为非弥漫型时，手术是最佳的治疗方法，但对于肝硬化患者，化疗就成为最佳选择，因此，探索新的药物治疗方式是十分必要的。探索新的治疗方式十分必要［2］。一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内一种重要的信号分子，参与调节许多关键的生理过程，如血管舒张，血小板聚集，激素分泌，胃肠道活动性和伤口愈合等。高浓度NO具有抗肿瘤作用，可通过抑制肿瘤细胞转移，促进细胞凋亡等影响肿瘤的发生发展，NO的靶向释放为抗肿瘤治疗提供新思路［3-4］。O2-（2，4-二硝基苯基）1-〔（4-乙氧基羰基）哌嗪-1-基〕重氮-1-1，2-二醇脂（C13H16N6O8，JS-K）是一种有效的NO前药，是偶氮鎓二醇盐化合物家族的新型NO供体。它在人体内与谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase，GST）产生反应，在此过程中能够持续在细胞内释放NO，而GST通常在肿瘤细胞中过表达［5］。越来越多的证据表明，JS-K在体外和体内均可影响肿瘤的发生发展，如胃癌、前列腺癌、肾癌和肝癌等［6-9］。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）属于磷酸蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatase，PPP）家族，包含细胞丝氨酸/苏氨酸磷酸酶［10］。多种类型肿瘤的发生都与PP2A活性降低有关［11-12］。PP2A作为一种肿瘤抑制因子，通过去磷酸化作用，下调与肿瘤进展相关的许多增殖信号通路以及通路中的蛋白质表达，如Wnt/β-联蛋白，细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）［13-15］。前期研究显示，NO 供体 JS-K 通过调节PP2A活性可诱导细胞凋亡［16］。因此，本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象，观察JS-K对肝癌细胞凋亡的影响，探索PP2A和PI3K/Akt通路在其中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和主要仪器

人肝癌HepG2细胞，由本实验中心保存。DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（以色列BI公司），JS-K和小鼠抗人p-PP2A-c单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），膜联蛋白AnnexinVFITC/PI双染试剂盒（美国BD公司），MTT（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），NO清除剂2-（4-羧苯基）-4，4，5，5-四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化钾（羧基-PTIO）和DAPI染色液（上海碧云天生物技术有限公司）；PI3K抑制剂LY294002、PP2A抑制剂冈田酸（okadaic acid，OA）、兔抗人 PP2A、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）和p-mTOR单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），β肌动蛋白和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

Microfuge 20R高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司），Axio Observer 3倒置荧光显微镜（德国蔡司公司），电泳仪DYCZ-40D（北京六一科技有限公司）；全波长酶标仪（中国基因有限公司），全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技有限公司），BD Accuri C6流式细胞分析仪（美国BD公司）。

1.2 细胞培养和处理

将冻存的HepG2细胞复苏后用含有10%胎牛血清、青霉素100 IU·mL-1和链霉素100 μg·mL-1的DMEM高糖培养基在含5%CO2、37℃湿润环境培养至对数生长期，备用。将细胞随机分为细胞对照组（只加等量二甲亚砜，终浓度＜0.01%）、JS-K 2.5，5.0 和 10.0 μmol·L-1组、LY294002 10 μmol·L-1组、OA 1 nmol·L-1组、羧基-PTIO 50 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组。以上分组药物单独处理细胞24 h，联合用药中LY294002、OA和羧基-PTIO单独预处理细胞1 h后加JS-K 10.0 μmol·L-1共同处理24 h。

1.3 DAPl染色检测细胞凋亡形态

按1.2分组，将对数生长期的HepG2细胞接种于48孔细胞板中培养贴壁后，给药处理24 h后，后用PBS洗涤2次，加适量DAPI染色液，避光孵育5 min后，弃DAPI染色液，PBS洗涤2次，用荧光显微镜观察细胞形态。

1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

按1.2分组，将HepG2细胞接种于6孔板中，给药处理24 h，用胰酶消化并收集细胞于离心管内，367×g离心5 min后弃去上清，重新悬浮于500 μL缓冲液中。然后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，在黑暗环境中放置20 min之后将染色细胞进行流式细胞仪分析，并用Cell Quest软件计算凋亡率。

1.5 Western印迹法检测细胞PP2A，Pl3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

按1.2分组，药物处理细胞24 h后，加含有PMSF的蛋白裂解液提取细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度，充分变性后用12%SDS-PAGE进行电泳，再将电泳后的蛋白转至PVDF膜，后用5%脱脂奶粉将膜封闭1 h，一抗（1∶1000）4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。二抗（1∶3000）37℃室温孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL发光液显影，采用Image J软件对蛋白条带积分吸光度值进行半定量分析。以磷酸化蛋白与总蛋白积分吸光度比值表示蛋白磷酸化水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 JS-K对HepG2细胞形态的影响

DAPI染色结果（图1）显示，OA 1 nmol·L-1组和羧基-PTIO 50 μmol·L-1组细胞染色质和细胞核无明显形态上的变化，JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1组、LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组出现细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞。JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞数有所增加，JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞数有所减少。

Fig.1 Effect of JS-K on HepG2 cell apoptosis by DAPl staining.HepG2 cells were treated with JS-K 2.5，5.0 and 10.0 μmol·L-1，LY294002 10 μmol·L-1，okadaic acid（OA）1 nmol·L-1，and carboxy-PTIO 50 μmol·L-1alone for 24 h.The cells were pretreated with LY294002 10 μmol·L-1，OA 1 nmol·L-1，or carboxy-PTIO 50 μmol·L-1for 1 h，followed by JS-K 10.0 μmol·L-1for 24 h.1：cell control group；2：JS-K 2.5 μmol·L-1；3：JS-K 5.0 μmol·L-1；4：JS-K 10.0 μmol·L-1；5：LY294002 10 μmol·L-1；6：OA 1 nmol·L-1；7：carboxy-PTIO 50 μmol·L-1；8：JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1；9：JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1；10.JS-K 10.0 μmol·L-1+carboxy-PTIO 50 μmol·L-1.Arrows show the changes of nuclear morphology.

2.2 JS-K对HepG2细胞凋亡率的影响

Annexin V-FITC/PI双染结果（图2）显示，与细胞对照组比较，OA 1 nmol·L-1组和羧基-PTIO 50 μmol·L-1组细胞凋亡率无明显变化，JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1组、LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol· L-1+OA 1 nmol· L-1组 和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组细胞凋亡率明显增加（P＜0.01）。与JS-K 10.0 μmol·L-1组比较，JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组细胞凋亡率明显增加（P＜0.05），JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组细胞凋亡率明显下降（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of JS-K on apoptotic rate of HepG2 cells by flowcytometry.See Fig.1 for the cell teatement and the legend.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1 alone group.

2.3 JS-K对HepG2细胞内PP2A蛋白磷酸化水平的影响

Western印迹实验结果（图3）显示，与细胞对照组相比，LY294002 10 μmol·L-1组和羧基-PTIO 50 μmol·L-1组PP2A蛋白磷酸化水平无显著变化，OA 1 nmol·L-1组PP2A蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.05），JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组PP2A蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.01）；与 JS-K 10.0 μmol·L-1组比较，JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmo·L-1组 PP2A 蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.01）。

Fig.3Effect of JS-K on phosphorylation levels of protein phosphatase 2A（PP2A）in HepG2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment and the leged.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1alone group.

2.4 JS-K对Pl3K/Akt信号通路相关蛋白磷酸化的影响

Western印迹实验结果（图4）显示，与细胞对照组相比，OA 1 nmol·L-1组和羧基-PTIO 50 μmol·L-1组PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平无显著变 化，JS-K 2.5～10.0 μmol· L-1组、LY294002 10 μmol· L-1组、JS-K 10.0 μmol· L-1+LY294002 10 μmol·L-1组、JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和 JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与JS-K 10.0 μmol·L-1组比较，JS-K 10.0 μmol· L-1+LY294002 10 μmol· L-1组PI3K、Akt和mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P＜0.05），JS-K 10.0 μmol·L-1+OA 1 nmol·L-1组和JS-K 10.0 μmol·L-1+羧基-PTIO 50 μmol·L-1组PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of JS-K on phosphorylation levels of phosphatidylinositol 3-kinase（Pl3K），protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）of HepG2 cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment and the legend.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with JS-K 10.0 μmol·L-1alone group.

3 讨论

本研究发现，NO供体JS-K 2.5～10.0 μmol·L-1可显著增加HepG2细胞凋亡率，且核碎裂、染色质聚集等凋亡特征的细胞数明显增加，降低PP2A蛋白磷酸化水平，减少PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平。JS-K 10.0 μmol·L-1与LY294002联用，可增强JS-K诱导的HepG2细胞凋亡率，进一步降低PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平。JS-K 10.0 μmol·L-1分别与 OA 1 nmol·L-1和羧基-PTIO 50 μmol·L-1联用，可降低JS-K诱导的HepG2细胞凋亡率，PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高。

细胞凋亡的抑制或调节失控与肿瘤的发生发展密不可分。PP2A是细胞内重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，可使已磷酸化的蛋白质脱磷酸，从而对细胞内众多信号通路起到重要的调节作用。PP2A活性增强可促进细胞凋亡，PP2A活性丧失，则细胞凋亡受阻。在体内重要的抗凋亡途径中，PI3K/Akt途径的重要成员Akt的活性也受到PP2A的调节。PP2A B55α亚基的表达减少导致Akt的激活增加，从而促进肿瘤细胞的生长和增殖；而增强PP2A介导的Akt的脱磷酸化作用，可引起mTOR复合体1受到抑制，则进一步抑制肿瘤的增殖［17］。本研究结果显示，JS-K可显著增加HepG2细胞凋亡，PI3K抑制剂LY294002和JS-K联合处理细胞后，细胞凋亡率显著增加；但经PP2A抑制剂OA或NO清除剂羟基-PTIO处理后，JS-K诱导的HepG2细胞凋亡率明显减少，具有细胞染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征的细胞数也显著减少。由此提示，JS-K诱导细胞凋亡与其释放NO、激活PP2A，以及抑制PI3K/Akt有关。

由于PP2A参与了JS-K诱导的HepG2细胞凋亡，本研究进一步验证JS-K对HepG2细胞内PP2A蛋白磷酸化水平的影响。本研究结果显示，JS-K可显著降低PP2A的磷酸化水平，OA或羟基-PTIO均可减弱JS-K对PP2A蛋白磷酸化水平的降低作用，而LY294002对PP2A蛋白磷酸化水平未见明显影响。结果提示，JS-K通过释放NO而降低细胞内PP2A磷酸化水平。在肿瘤细胞中，PP2A通过多种机制失活，包括体细胞突变、磷酸化和（或）催化亚单位C端甲基化，以及通过增加内源性PP2A抑制剂的表达；一些如表皮生长因子、胰岛素受体的酪氨酸激酶均可使PP2A磷酸化而失活［18］。有研究表明，NO能够通过影响催化亚基C端尾部的翻译后修饰提升PP2A活性；NO活性氮引起的PP2A活性增加［19］。本课题组前期研究结果显示，JS-K可激活PP2A蛋白，激活活化胱天蛋白酶9/3和活化 PARP［16］。结合本实验结果提示，JS-K引起PP2A的激活与其降低磷酸化PP2A水平有关。

本研究随后通过加入PI3K抑制剂、PP2A抑制剂和NO清除剂来进一步探讨PI3K/Akt、PP2A和NO间的关系。本研究结果显示，JS-K可显著降低PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平，LY294002处理后可显著增强JS-K对PI3K/Akt通路的抑制，而OA或羟基-PTIO处理后则减弱了JS-K对PI3K/Akt通路的抑制，使PI3K，Akt和mTOR蛋白磷酸化水平升高。一些新型化合物可通过抑制PP2A/Akt途径在卵巢癌细胞中诱导线粒体途径凋亡［20］。刘雪文等［21］发现，活性化合物重楼皂苷G可通过激活PP2A而抑制Akt信号通路，从而抑制淋巴瘤细胞生长并促进凋亡及自噬。因此，通过影响PP2A/Akt通路是一种有效的抗肿瘤方法。结合上述研究报道提示，JS-K降低PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平与其释放NO激活PP2A有关。

综上所述，NO供体JS-K可通过在HepG2细胞内释放NO，激活PP2A，降低PI3K/Akt/mTOR通路蛋白磷酸化水平，诱导细胞凋亡。这为进一步研究NO在肿瘤调控中的作用提供了重要的理论基础，更为NO供体型药物的开发和利用提供了一定的理论依据。