独蒜兰优质种苗快速培育研究

王跃华,陈 芳，鲜俊贤,宋沐航，高 首，张 旭

(1.成都大学 食品与生物工程学院，四川 成都 610106；2.成都列五中学，四川 成都 610056)

0 引 言

独蒜兰是兰科独蒜兰属多年生半耐寒附生或地生珍稀植物[1].独蒜兰主要分布于我国的贵州、四川和云南等地，其假鳞茎半埋于苔藓或枯枝落叶分解的有机质层中[2].独蒜兰植物的干燥假鳞茎为中药材山慈菇,具有清热解毒，消肿散瘀的功效[3-4]，内服可治肝癌、乳腺癌和子宫癌等，外用可治疮毒、蛇虫咬伤和皮肤烫伤及烧伤等.另外，独蒜兰作为兰科植物，以其花形奇异、花色多样而具有极高的观赏价值[5]，已列入中国珍稀濒危植物名录中，是我国特有的二级珍稀濒危保护植物.独蒜兰植物种子细小且无胚乳结构，其种皮的透气和透水性也不太好，导致独蒜兰种子在自然界中萌发率极低.故本研究利用生物技术，从多个方面开展了提高独蒜兰种子萌发条件的研究.

1 材料与方法

1.1 材 料

独蒜兰植物蒴果采于四川省都江堰市龙池镇，经四川师范大学生命科学院马丹炜教授鉴定为兰科独蒜兰属独蒜兰植物.

1.2 方 法

1.2.1 不同基本培养基对独蒜兰种子萌发的影响

将经过0.05 mol/L次氯酸钙浸种处理的独蒜兰种子分别接种在MS、1/2MS、1/4MS和B5基本培养基中，加入20 g/L蔗糖.以种子突破种皮为萌发标准，30 d后统计独蒜兰种子萌发率.

1.2.2 独蒜兰丛生芽增殖培养研究

选取带顶芽的独蒜兰培养材料，在接入培养基前切除顶芽部分，采用L16(43)正交试验设计，研究对独蒜兰植物丛生芽诱导增殖的影响见表1，本实验采用的基础培养基为B5+2 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.

表1 水平因素表

1.2.3 独蒜兰无根苗生根壮苗研究

以1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作为基础培养基，添加不同浓度的6-BA(0.0、0.1、0.3、0.5mg/L)和IBA(0.0、0.1、0.2、0.3 mg/L)，培养60 d后统计独蒜兰无根苗的生根率和平均生根数.

1.2.4 数据计算公式

种子萌发率=(突破种皮的种子数/种子总数)×100%

丛生芽诱导率=(诱导出丛生芽的培养材料/接种的培养材料)×100%

产生丛生芽的平均数= 产生丛生芽的总个数/诱导出丛生芽的培养材料

生根率= (生根的无根苗数/接种的无根苗数)×100%

平均生根数= 生根总数/生根的无根苗数

5株独蒜兰组培苗平均鲜重：随机秤取5株独蒜兰组培苗的重量

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对独蒜兰种子萌发的影响

本研究将处理后的种子接入不同基本培养基中，在培养温度为(20±2)℃，光照强度为500～800 lx，光照时间24 h/d的条件下培养30 d后，统计实验结果见表2.

表2 不同基本培养基对种子萌发的影响

由表2可以看出，在A1～A4中，以A4即B5基本培养基的种子萌发率最高为92 %；A3即在1/4MS培养基种子萌发率最低为79.33 %.综上所述，B5培养基更有利于独蒜兰种子萌发，这与张丽娜等[4]对独蒜兰种子萌发研究结果一致，即B5培养基促进种子萌发和原球茎生长的优势更明显.黄永会等[5]在对云南独蒜兰进行种子萌发时，也确定B5培养基效果最佳.

2.2 正交试验研究独蒜兰丛生芽诱导增殖

采用正交试验设计，将切去顶芽的独蒜兰培养材料接入L16(43)正交试验的培养基中，在温度为(20±2)℃，光照强度为2 000～2 300 lx，光照时间为24 h/d的培养条件下，培养60 d后，统计试验结果见表3，方差分析见表4.

表3 不同因素对丛生芽诱导增殖的影响

表4 方差分析表

由表3可知，不同因素对独蒜兰丛生芽诱导和增殖效果都不一样.分别从丛生芽诱导率和平均产生丛生芽数两个指标来看，编号12配方即A3B4C4的丛生芽诱导率最高为93 %，编号7配方即A2B3C3产生丛生芽平均数最高为7.63个.通过观察发现，切除带顶芽培养材料在接入编号12培养基后15 d，在材料的切口处出现明显膨大，并开始愈伤化，随着培养时间的增加，在愈伤化的组织表面开始长出浅绿色的多个小芽点，随后芽点逐渐长大，可形成带有2～3片小叶的无根幼苗.

通过极差分析3个因素对丛生芽的诱导率影响大小分别为A>C>B，即TDZ的影响最大的，肌醇次之，KT影响最小；进一步根据各水平的均值大小，筛选出了丛生芽诱导的最佳组合为A3B2C4，即为B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20 g/L蔗糖.通过进一步验证实验，获得丛生芽诱导率在培养60 d后可达到98.00%，平均产生丛生芽数达到6.80个.

通过极差分析3个因素对产生丛生芽的平均数影响大小依次为A>B>C，即TDZ的影响最大的，KT影响次之，肌醇影响最小；进一步根据各水平均值大小，确定了丛生芽数增殖的最佳组合为编号7配方，即A2B3C3.

根据表4方差分析结果可知，对丛生芽诱导率，因素A即TDZ达到了极显著水平，因素C即肌醇达到了显著水平，说明TDZ因素对丛生芽诱导率影响最大，其次是肌醇，影响最小的因素是KT.根据Duncan检验结果表明，TDZ对丛生芽诱导率影响最大的是水平3，即浓度为2.0 mg/L，肌醇影响最大的水平为4，即浓度为200.0 mg/L.

对产生丛生芽的平均数，因素A即TDZ达到了极显著水平，因素B即KT达到了显著水平，根据Duncan检验结果表明，TDZ对增加丛生芽平均数影响最大的水平为2,即浓度为1.0 mg/L ，KT影响最大的水平为3，即浓度为1.5 mg/L.

由此可见，方差分析的结果与极差分析结果是一致的，说明TDZ、KT和肌醇对于丛生芽诱导和增加丛生芽数都具有重要的作用.

综上，本研究选择A3B2C4，即为B5+TDZ 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+200.0 mg/L肌醇+2.0 g/L活性炭+20.0 g/L蔗糖作为独蒜兰丛生芽诱导增殖最佳配方.

2.3 独蒜兰无根苗生根壮苗研究

切取丛生芽上生长长度为2.0～3.0 cm的无根苗(见图1)，接入1/2MS+ 2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+30.0 g/L蔗糖作为基础培养基，并添加不同植物生长调节剂的配方中，在温度为(20±2)℃，光照强度为1 800～2 100 lx，光照时间12 h/d的条件下，培养60 d，统计实验结果见表5.

图1 独蒜兰丛生芽

表5 不同植物生长调节剂对无根苗生根壮苗的影响

续 表

由表5可知，在B1组不添加任何植物生长调节剂的培养基中，其无根苗的生根率和平均生根数都是较低的，即生根率为64.67%、平均生根数1.83条，并且测得独蒜兰组培苗的重量也是最轻的，即5株独蒜兰组培苗的平均鲜重仅为7.60 g；在B2～B4组中，即6-BA浓度保持在0.1 mg/L，IBA浓度由0.1 mg/L上升到0.3 mg/L时，其生根率、平均生根数和平均鲜重都呈现出先升高后降低的变化，其中以B3组，即当在6-BA浓度为0.1 mg/L、IBA浓度为0.2 mg/L时，其生根率、平均生根数和平均鲜重都是最高，即生根率为100 %，平均生根数为3.20条、5株独蒜兰组培苗的平均鲜重为21.11 g；在B10组中，当培养基中植物生长调节剂浓度都升到最高，即6-BA浓度为0.5 mg/L，IBA浓度为0.3 mg/L时，生根率和平均生根数却都是最低，即生根率仅为61.67%,平均生根数仅为1.73条.

综上所述，独蒜兰的最佳生根壮苗培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖，培养60 d后，其独蒜兰植株的生根率为100.00%，平均生根数为3.20条，平均鲜重为21.11 g，见图2.

图2 独蒜兰组培苗

3 讨 论

兰科植物在利用生物技术快速繁殖培养过程中，大多数会采用根状茎增殖，极少会形成类似愈伤组织的结构[6].陈进勇等[7]用惠兰和墨兰种子进行培养时，在植物生长调节剂的作用下通过诱导愈伤组织形成，进一步分化出芽.TDZ是苯基脲型的细胞分裂素，可以去除顶端优势，诱导形成丛生芽或者侧芽[8].张月琴等[9]发现4.0 mg/L TDZ处理可以使小麦幼胚茎尖诱导形成丛生芽.本研究采用了较高浓度的TDZ培养去掉了顶芽的独蒜兰培养材料，结果发现培养材料在愈伤化的基础上，可进一步诱导产生出丛生芽，这与文献[10]的研究结果一致.

在诱导培养丛生芽过程中，添加一定浓度的肌醇物质，对独蒜兰植物组织细胞快速生长有促进作用.刘宝光等[11]在红皮云杉的胚性愈伤组织的增殖培养中，通过添加适当浓度的肌醇，可诱发红皮云杉早期原胚的形成.另外，肌醇还是植物抗逆环境生长的关键因子，在某些植物细胞程序死亡的过程中，有发挥信号分子的作用[12].

生根壮苗是完成独蒜兰优质种苗培育至关重要的一步.本研究通过对基本培养基和植物生长调节剂的研究，获得了独蒜兰生根壮苗的最佳培养基为1/2MS+IBA 0.2 mg/L +6-BA 0.1 mg/L+2.0 g/L活性炭+30.0 g/L土豆泥+20.0 g/L蔗糖.此研究成果可为工厂化生产独蒜兰优质种苗提供重要的技术支撑，在一定程度上可缓解独蒜兰植物资源严重短缺的难题.