两次卵巢发育成熟拟穴青蟹卵巢与肝胰腺营养成分比较分析

喻国洪, 王扬才, 金中文

(1. 宁波大学 海洋学院, 浙江 宁波 315832; 2. 宁波市海洋与渔业研究院, 浙江 宁波 315408)

拟穴青蟹(Scylla paramamosain, 以下简称青蟹)隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Syclla), 主要分布于中国浙江、福建、广东、海南等东南沿海各地区, 是中国重要的经济蟹类之一。青蟹营养丰富、味道鲜美、经济价值高, 卵巢发育至Ⅴ期成熟期的雌蟹俗称“红膏蟹”, 市场价格为普通青蟹的两倍以上[1], 而膏蟹一旦产卵抱卵, 其经济价值大幅下降。在浙江沿海, 青蟹一般9月—10月进行生殖脱壳并交配, 到次年4月—5月产卵, 第一次卵巢发育历时7～8个月, 营养积累时间长。而产卵1次后的青蟹无需再交配, 再经过1个月的培育, 有些雌蟹的卵巢即可二次发育成熟, 成熟后的卵子也能正常受精、抱卵和孵化。肝胰腺和卵巢是其重要的可食部位, 目前有关青蟹卵巢发育的研究多集中于第一次发育卵巢[2-3], 而青蟹卵巢二次发育时间远短于第一次卵巢发育, 其卵巢和肝胰腺营养积累状况如何目前研究较少。因此, 本文对卵巢二次发育红膏蟹卵巢和肝胰腺的主要营养成分进行分析和评价, 并与卵巢一次发育红膏蟹对比, 以期为青蟹开发利用及亲本培育提供理论参考和实践依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源及制备

第一次卵巢发育青蟹样本为2017年繁育的苗种经过1 a养殖达到育苗要求的亲本个体。二次卵巢发育青蟹取自本课题组2018年3月春季育苗, 初次产卵后经过50 d左右强化培育的亲本个体。青蟹选择甲壳两侧充满性腺, 在光线下观察已无透明区域, 解剖后卵巢呈鲜亮桔红色、卵粒可辨、镜检卵巢发育达Ⅴ期的青蟹。取二次发育和一次发育青蟹各5只, 用镊子等工具取出全部卵巢、肝胰腺, 将样品分为两份, 一份放置-20 ℃冰箱中冷冻保存, 用于一般营养成分测定; 另一份放置-80 ℃冰箱中冷冻保存, 用于氨基酸、脂肪酸测定。实验用二次卵巢发育青蟹平均体质量为(344.88±99.07) g、平均壳长(8.71±0.82) cm、平均壳宽(12.61±1.19) cm, 与一次卵巢发育青蟹规格(平均体质量(277.44±57.8) g、平均壳长(7.94±0.56) cm、平均壳宽(11.53±0.79) cm无显著差异(P＞0.05)。

1.2 营养成分测定

水分、粗蛋白、粗脂肪测定分别按照国标GB5009.3—2016、GB5009.5—2016、GB 5009.6—2016测定, 氨基酸分析采用酸水解液质联用外标法(LC/MS)[4], 由于采用酸水解法处理样品, 因此本文不考虑色氨酸的检测。脂肪酸组成分析采用气质联用外标法(GC/MS)[5], 根据脂肪酸标准品的分析图谱, 以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标做标准曲线, 根据样品溶液的峰面积在曲线上读取样品中绝对含量。

1.3 营养评价

卵巢指数(gonad somatic index, GSI, %)=卵巢质量/体质量×100。肝胰腺指数 (hepatopancreas somatic index, HSI, % ) =肝胰腺质量/体质量×100。根据联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)1973年建议的氨基酸评分标准模式和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)、必需氨基酸指数(EAAI)[6-7], 计算脂肪酸致动脉粥样硬化指数(IA)和血栓形成指数(IT)[8], 以评估青蟹卵巢和肝胰腺脂肪酸对人类心血管疾病发生的影响。

式中, MUFA为多不饱和脂肪酸; PUFA为单不饱和脂肪酸。

1.4 抱卵率与抱卵量的计算

抱卵率=抱卵只数/初始总只数。

绝对抱卵量=产卵总质量×样本卵数/样本卵质量。取样的卵均为产卵8 h～16 h间胚胎处于卵裂期的蟹。随机取5份0.1 g卵, 数出卵数后取平均数。

1.5 数据分析统计

采用SPSS统计软件(SPSS 20)进行统计分析, 所有数据均以平均值±标准差表示。T-Text检验方法分析, 取P＜0.05为差异显著标准,P＜0.01为极显著差异标准。

2 结果

2.1 常规营养成分

第二次卵巢发育成熟的青蟹其GSI显著低于第一次卵巢发育成熟的个体(P＜0.01)(表1), 肝胰腺粗脂肪含量显著低于第一次卵巢发育成熟的个体(P＜0.05)。而HSI在两次发育中并无显著差异(P＞0.05)。卵巢和肝胰腺中粗脂肪和粗蛋白在两次卵巢发育成熟样本个体中无明显差异(P＞0.05), 卵巢中粗蛋白含量高于肝胰腺、而粗脂肪含量比肝胰腺低。

表1 第一次和第二次卵巢发育成熟拟穴青蟹GSI、HSI及卵巢和肝胰腺常规营养(%, 干质量, n = 5)Tab. 1 GSI, HSI, and nutrient contents of the ovaries and hepatopancreas of mud crabs (%, fresh weight, n = 5)

2.2 脂肪酸组成、含量比较及营养评价

两次卵巢发育成熟青蟹的卵巢中均检测出30种脂肪酸, 其中饱和脂肪酸(saturated fatty acid, SFA)14种、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA) 6种和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA) 10种(表2)。其中, 含量排前两位的SFA为棕榈酸(C16: 0)和硬脂酸(C18: 0), 含量排前两位的MUFA为C18: 1(ω-9)和C16: 1(ω-7), PUFA为C22: 6(ω-3)(DHA)和C20: 5(ω-3)(EPA), 这6种脂肪酸占二次卵巢发育成熟青蟹卵巢总脂肪酸(total fatty acid, TFA)的83.05%, 占一次卵巢发育成熟青蟹TFA的82.25%。SFA、MUFA、PUFA和TFA在两次卵巢发育成熟青蟹卵巢中均无显著差异(P＞0.05)。肝胰腺中检测出30种脂肪酸, 其中SFA14种, MUFA6种和PUFA10种。含量较高的脂肪酸同样是C16: 0、C18: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 1(ω-9)、C20: 5(ω-3)、C22: 6(ω-3)等, 分别占二次卵巢发育成熟青蟹肝胰腺总脂肪酸的76.99%, 占一次卵巢发育成熟青蟹总脂肪酸的78.32%, 该6种主要的脂肪酸在两次卵巢发育成熟青蟹中的肝胰腺内均存在显著差异, 二次卵巢发育显著低于一次卵巢发育(P＜0.05)。SFA、MUFA、PUFA和TFA在二次卵巢发育和一次卵巢发育成熟青蟹肝胰腺中有显著性差异(P＜0.05), 二次卵巢发育青蟹的主要供能脂肪酸C16: 0、C18: 0、C16: 1、C18: 1显著性低于一次卵巢发育青蟹(P＜0.05)。

表2 拟穴青蟹第一次和第二次卵巢发育中卵巢和肝胰腺中脂肪酸的组成（mg/g干质量, n = 5）Tab. 2 Composition of fatty acids in ovaries and hepatopancreas of the first and the second ovarian development of mud crab(mg/g dry weight, n = 5)

续表

二次卵巢发育成熟青蟹卵巢中UFA(unsaturated fatty acid, 不饱和脂肪酸)/SFA为2.17, 一次卵巢发育为2.09, 显著(P＜0.05)高于两次卵巢发育成熟青蟹肝胰腺中的UFA/SFA(一次为1.44、二次为1.55), 表明卵巢中脂肪酸不饱和度更高, 而两次卵巢发育成熟青蟹卵巢和肝胰腺前后无显著差异(P＞0.05)。卵巢中(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA分别为一次4.09和二次4.25, 肝胰腺中为一次2.59和二次2.84。一次和二次卵巢发育的青蟹卵巢的IA和IT分别为0.35、0.35和0.29、0.29, 肝胰腺的IA和IT分别为0.53、0.56和0.45、0.45, 两次卵巢发育相比卵巢和肝胰腺均比较接近。

2.3 氨基酸组成及营养评价

两次卵巢发育青蟹卵巢和肝胰腺中氨基酸组成类似, 均检测出17种氨基酸, 其中人体所需的必需氨基酸(essential amino acids, EAA)9种(色氨酸因酸水解被破坏而无法检出), 非必需氨基酸(non-essential amino acids, NEAA)8种(表3)。由表3可知, 9种EAA中含量高低依次为赖氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸, 卵巢中含量低于10 mg/g的为甲硫氨酸和半胱氨酸, 肝胰腺中含量低于10 mg/g的为甲硫氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。除二次卵巢发育肝胰腺中半胱氨酸显著高于一次卵巢发育外, 其余EAA无论在卵巢还是肝胰腺中均无显著差异(P＞0.05)。NEAA中精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量较高, 占总NEAA的50%以上。无论卵巢还是肝胰腺, 卵巢二次发育青蟹的EAA、NEAA、TAA含量与卵巢一次发育青蟹无显著差异(P＞0.05)。

表3 第一次和第二次卵巢发育成熟拟穴青蟹卵巢和肝胰腺氨基酸的组成(mg/g干质量, n = 5)Tab. 3 Amino acid composition in the ovaries and hepatopancreas of mud crabs in the first and second stages of ovarian development (mg/g dry weight, n = 5)

续表

一次和二次卵巢发育青蟹卵巢的EAA/TAA分别为0.45和0.44, 肝胰腺的EAA/TAA都为0.43。由表4可知, 卵巢中的氨基酸得分(AAS)均高于肝胰腺, 二次卵巢发育青蟹AAS均低于一次卵巢发育青蟹, 卵巢和肝胰腺中第一和第二限制性氨基酸均为蛋氨酸+半胱氨酸和亮氨酸, 必需氨基酸指数(EAAI)卵巢高于肝胰腺, 一次卵巢发育高于二次卵巢发育, 两次卵巢发育青蟹的肝胰腺中呈味氨基酸[9](Taste Amino Acid, TAA)(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸)与总氨基酸比值DAA/TAA分别为0.39和0.40, 高于卵巢中的0.35和0.36。

表4 第一次和第二次卵巢发育成熟拟穴青蟹卵巢和肝胰腺的必需氨基酸成份评价(mg/gN, 干质量, n = 5)Tab. 4 Evaluation of the EAA composition of the ovaries and hepatopancreas of mud crabs in the first and the second stages of ovarian development (mg/g N dry weight, n = 5)

2.4 抱卵率与抱卵量的比较

由表5 可知, 一次卵巢发育青蟹的抱卵率为69.4%明显大于二次卵巢发育青蟹的20%。计算得出处于卵裂期的卵为5.58万粒/g, 从而算出第一次卵巢发育青蟹的平均绝对抱卵量为(341.3±45.6)万粒, 显著(P＜0.05)高于二次卵巢发育青蟹的(235.2±17.82)万粒。

表5 第一次和第二次卵巢发育拟穴青蟹抱卵率与抱卵量的比较Tab. 5 Comparison of the egg-carrying rate and number of eggs carried in the mud crab during the first and second stages of ovarian development

3 讨论

3.1 常规营养

拟穴青蟹卵巢和肝胰腺营养成分是衡量养殖产品特别是红膏蟹品质的重要指标。分析结果表明, 二次卵巢发育成熟青蟹的性腺指数GSI显著低于第一次卵巢发育成熟青蟹(P＜0.05), 且肝胰腺粗脂肪含量也显著低于第一次(P＜0.05)。脂肪含量与锯缘青蟹中的报道相一致[10], 粗蛋白含量在卵巢中高于中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis), 而肝胰腺中较低[11]。青蟹第一次抱卵期间能量消耗巨大, 卵巢二次发育过程时间短, 即使饵料充足条件下卵巢二次发育成熟青蟹的GSI也远低于一次卵巢发育成熟青蟹, 表明卵巢二次发育的青蟹生殖力下降, 这与中华绒螯蟹第二次卵巢发育研究结果基本一致[12]。造成这种差异的主要原因是, 首先两次卵巢发育的时间长短不同,第一次卵巢发育的青蟹从9—10月份一直到翌年3月份至卵巢成熟, 其经历了越冬的强化培育, 故其肝胰腺中积累了大量的营养物质供卵巢发育。而第二次卵巢发育的时间仅50 d左右, 在第一次抱卵期间能量消耗巨大, 为保证卵巢发育的正常进行, 其肝胰腺脂类的代谢活动大大加强, 不断的由食物中摄取脂类物质并合成脂肪, 迅速转移至正在旺盛发育的卵巢[10]。其次, 两次卵巢发育起点不同, 第一次卵巢发育起点是由卵原细胞开始逐渐发育为成熟的卵母细胞, 而第二次卵巢发育的起点主要为卵黄合成前的卵母细胞和内源卵黄合成期的卵母细胞[13]。

3.2 脂肪酸

本研究结果表明, C16: 0、C18: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 1(ω-9)、C20: 5(ω-3)、C22: 6(ω-3)是青蟹卵巢和肝胰腺主要的脂肪酸。随着二次卵巢发育成熟, 卵巢当中的这些物质含量上升, 且趋于一次发育卵巢的正常水平。甲壳动物在性腺发育过程中对脂肪酸的需求量是一定的, 在饵料充足的情况下, 卵巢发育最接近正常值[14]。然后胚胎发育和幼体的生长蜕壳需要卵巢积累足够的卵黄物质[15], 而卵黄物质中主要是蛋白质和脂肪, 其含量相对稳定[16]。这与于智勇[12]在中华绒螯蟹第二次卵巢发育中的结果相似。肝胰腺中的这些物质则反向变化, 均显著低于一次卵巢发育青蟹。有研究表明, 在卵巢发育过程中,肝胰腺中脂类的合成比卵巢强的多, 虽然卵巢也合成一部分, 但是有相当一部分是从肝胰腺中通过血液运输以磷脂的形式转移而来[2]。主要的能量型脂肪酸(C16: 0、C16: 1(ω-7)、C18: 0、C18: 1(ω-9)), 两次卵巢发育青蟹卵巢中并无显著差异。它们在卵巢发育过程中积累, 供其后面的胚胎发育及幼体生长使用[12]。DHA、EPA、LA和LNA是青蟹的必须脂肪酸(EFA), 青蟹自身无法合成, 只能从食物中摄取获得, 它们对卵子的受精和孵化、幼体存活、生长和变态以及维持成体正常生长和繁殖等均具有重要的营养作用[2]。两次卵巢发育卵巢中EFA无显著差异另外C20: 4(ω-6)是合成前列腺素的主要前体, 前列腺素对于甲壳类等许多无脊椎动物的产卵和孵化起重要作用[17]。本研究结果发现两次卵巢发育卵巢中C20: 4(ω-6)也无显著差异。以上这些重要的脂肪酸在两次卵巢发育中差异都不显著, 说明二次卵巢发育卵巢中的营养能够满足后期胚胎发育及早期幼体的发育。在实际生产中, 我们也发现, 二次卵巢发育的青蟹抱卵率和抱卵量低于一次卵巢发育青蟹, 但是早期幼体的质量以及出苗量与第一次接近, 没有明显的生殖性能的下降。这不同于中华绒螯蟹, 中华绒螯蟹第二次产卵的生殖性能和苗种的质量远远不及。第一次产卵[18]。但是与三疣梭子蟹(Portunus trituber-culatus)相似, 三疣梭子蟹二次与一次发育成熟的卵巢的GSI以及生殖性能比较接近[13]。

两次卵巢发育青蟹卵巢中UFA/SFA显著(P＜0.05)大于肝胰腺, 表明卵巢中脂肪酸不饱和度更高,而两次卵巢发育的青蟹卵巢和肝胰腺前后差异不大。两次卵巢发育成熟青蟹卵巢中(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA都远高于FAO/WHO推荐的(ω-3)PUFA/(ω-6)PUFA日常膳食0.1～0.2, 表明青蟹卵巢和肝胰腺可有效补充膳食中的(ω-3)PUFA。两次卵巢发育青蟹的卵巢和肝胰腺的IA和IT均比较接近, 无显著差异(P＞0.05)。但远低于猪肉(IA: 0.6; IT: 1.37)、牛肉(IA: 0.72; IT: 1.06)和羊肉(IA: 1.00; IT: 1.58), 表明卵巢发育成熟的青蟹卵巢和肝胰腺具有降血脂、抗动脉硬化等预防心血管疾病的功效[19]。

3.3 氨基酸

两次卵巢发育青蟹卵巢中的TAA和EAA都显著高于肝胰腺, 但EAA/TAA却比较接近, 都在0.43～0.45范围内, 青蟹的卵巢和肝胰腺前后两次卵巢发育EAA/TAA无显著差异(P＞0.05)。FAO/WHO/UNU(1985年)推荐食品中的EAA/TAA理想值在0.4左右[7],两次卵巢发育青蟹的卵巢和肝胰腺超过了0.4, 说明两次卵巢发育青蟹的卵巢和肝胰腺均具有较高的氨基酸营养价值, 蛋白质质量较好。EAAI是评价蛋白质营养价值的最常用指标之一, 数值越大, 表明营养价值越高[20]。一次卵巢发育青蟹卵巢EAAI为82.51显著高于(P＞0.05)二次卵巢发育青蟹卵巢73.91,而肝胰腺两次发育比较接近。说明一次卵巢发育成熟青蟹卵巢蛋白质营养价值更高。在味道方面, 两次卵巢发育成熟青蟹的肝胰腺DAA/TAA为0.39～0.40,大于两次卵巢发育成熟青蟹的卵巢0.35～0.36, 说明肝胰腺比卵巢更鲜美, 而两次卵巢发育成熟青蟹的卵巢和肝胰腺前后并无显著差异(P＞0.05)。

青蟹的胚胎发育与卵巢的蛋白质和氨基酸的积累有直接的关系。胚胎发育所需要的蛋白质和氨基酸营养仅靠母体储存在卵内的卵黄物质提供[21]。在红螯鳌虾(Cherax quadricarinatus)的胚胎发育过程中,有一部分蛋白质被用于构建组织和器官, 另一部分则被则被分解为胚胎发育提供所需要的能量[22]。青蟹生长所必需的的氨基酸有: 苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、亮氨酸、组氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸[20]。二次卵巢发育青蟹与一次卵巢发育青蟹在该10种EAA无显著差异(P＞0.05),而两次卵巢中的粗蛋白含量也无显著差异(P＞0.05),表明二次卵巢发育成熟青蟹的蛋白质和氨基酸营养与一次相近, 能满足胚胎的发育。

3.4 抱卵率与抱卵量的比较分析

一次卵巢发育成熟青蟹抱卵率远高于二次卵巢发育成熟青蟹, 且绝对平均抱卵量也显著(P＜0.05)高于二次卵巢发育成熟青蟹。说明二次卵巢虽能发育, 但抱卵率却很低, 其中的机制尚不明确。而二次卵巢发育青蟹的平均抱卵量低于第一次与前面的GSI相对应, 共同表明二次卵巢发育成熟青蟹生殖力低于第一次。

4 总结

综上所述, 二次卵巢发育成熟的青蟹GSI和抱卵率低于一次发育影响了其生殖力, 但其脂肪酸和蛋白质氨基酸营养与一次相近能满足胚胎的发育及初孵幼体的生长, 即两次卵巢发育青蟹生殖性能接近。在实际生产中可选用二次卵巢发育成熟的青蟹,通过合适的培育技术促进卵巢发育和排卵, 从而延长育苗的时间, 降低育苗亲本成本, 但因为抱卵率低, 故实际生产中因根据具体情况选择是否使用二次卵巢发育成熟的青蟹作为亲本培育。就营养价值而言, 两次卵巢发育成熟青蟹卵巢和肝胰腺都有较高的脂肪酸和氨基酸营养价值, 推荐食用。