昆虫中的核输出现象

吴一弘，陈国庆，王文凯，冯国忠*

(1.长江大学农学院，湖北荆州 434025；2.中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，杭州 310006)

昆虫是地球上数量最多的动物群体，昆虫的生理活动依赖于细胞中信号通路转导及各种基因的有序性表达。核质转运过程是真核生物细胞核膜内外物质平衡的基础(Lusk and King, 2017)。在细胞生命活动周期中，无论是转录因子类穿梭蛋白的核质转运、细胞分裂末期肌动蛋白的核内外平衡，还是未成熟的mRNA及各种小RNA的转运等都需要跨过细胞质与细胞核之间的核膜屏障。核膜内外周聚集着多种助力核质转运的蛋白，组装出复杂的核质转运结构。在昆虫的胚胎发育、代谢循环和免疫机制等生命活动中，一些重要的穿梭蛋白或RNA通过核输出机制从细胞核转运至细胞质中，行使其功能或进一步加工成熟。核输出的受阻使这些穿梭蛋白的功能遭受严重破坏，相应信号通路无法继续响应，严重时导致昆虫细胞死亡(Mason and Goldfarb, 2009)。

杆状病毒等病原物在侵入昆虫细胞并进行增殖时，也会争夺宿主的众多细胞器以及核质转运装置使病毒蛋白顺利穿梭核膜，同时也会抑制宿主编码的抗病毒因子mRNA的表达或分解宿主核膜蛋白组分以利于其在宿主细胞内的增殖复制。本文主要描述核质转运结构、蛋白核输出的基本机制及果蝇等昆虫中核输出的功能，简单介绍杆状病毒及一些虫媒病毒等对昆虫等宿主核输出机制的利用情况。

1 核孔复合体

真核生物的细胞核被核膜包被，基因组存在于细胞核内，确保了遗传物质的稳定性。核膜在空间上分隔开细胞核与细胞质的各种内容物，并在细胞分裂时短暂的消失，这是真核生物区别于原核生物的一个典型特征。真核生物基因在转录和翻译等表达调控过程中，核膜屏障在确保中心法则的核质交换时各细胞器有序地运且转互不干扰，保证细胞代谢运转的高效性和稳定性。不同的细胞器由膜状结构隔开，不同隔膜内的细胞器也需要广泛的信息交换。因此，分子之间需要频繁且可靠地进行跨膜运输，内质网、线粒体和高尔基等细胞器通过不同的途径进行信息交换，包括信号通路、转运体和囊泡运输等。细胞核和细胞质之间的分子跨核膜运输主要通过镶嵌在核膜上的核孔复合体(Nuclear pore complex, NPC)完成。NPC是一种巨大的蛋白质复合体，大约由30多种不同的核孔蛋白(Nucleoporin, Nup)重复16份拷贝组成一个八面对称的轮状结构，外径120 nm，高度70 nm，预测分子量为50～110 MDa(Devosetal., 2014; Guglielmietal., 2020)。在内质网的环状片层(Annulate lamellae, AL)上也存在一些类似NPC的结构，称为ALPC，但是没有核篮(Nuclear basket)与中心通道等结构(Hampoelzetal., 2016)。核质转运系统可以分为固定和流动两个部分，固定在NPC中的Nup包括多螺旋结构域与跨膜结构域的Scaffold-Nup和富含苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重复序列的FG-Nup，可移动部分的核转运受体蛋白(Karyopherin, Kap)短暂地结合至FG-Nup上运输货物蛋白。酿酒酵母Saccharomycescerevisiae中绝大部分的Nup位于NPC中，少量Nup存在于核仁、核散斑及内质网等结构。其中Scaffold-Nup构成NPC的结构框架，嵌合在核膜上，建立起一个内径大约50 nm的疏水通道，FG-Nup结合Kap并引导Kap-载运蛋白cargo复合体的运输(Routetal., 2000; Denningetal., 2003; Hampoelzetal., 2019; Mobbs and Hoelz, 2020)。

2 核质转运蛋白

2.1 Ran蛋白

Ran(Ras-related nuclear protein)是一种广泛存在的小分子G蛋白，在介导蛋白核质转运中起重要的调节作用，翻译后通过赖氨酸乙酰化起调节作用，泛素化的RanGTP酶激活蛋白(Ran GTPase-activating protein, RanGAP)在脊椎动物、酵母及植物中的氨基酸序列修饰及靶向作用存在很大差别(Mahajanetal., 1997; Quimby and Dasso, 2003)。Ran主要与核质转运相关，同时Ran在与组蛋白H3/H4结合促进NPC的组装、纤毛的形成以及微管的聚合等方面具有诸多调控功能，并与细胞有丝分裂中纺锤体的形成、维持和调控相关，通过释放纺锤体组装因子(Spindle assembly factor, SAF)介导有丝分裂功能，Ran与幼虫神经干细胞的时序性发育密切相关，敲除致死(Kahana and Cleveland, 1999; Dasso, 2001; Chenetal., 2015; Wuetal., 2019)。昆虫能通过上调Ran的表达进而调控NTF2(Nuclear transport factor 2)介导的核输入，提高多个解毒酶(Cyp4d20、Cyp4ae1、GstD5、Sod3)表达的效率以应对溴氰菊酯等药物的胁迫作用(Liuetal., 2016a; Karamipouretal., 2019)。家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus, AcMNPV)在感染宿主过程中通过编码microRNA(miRNA)下调宿主Ran蛋白的表达，从而调节宿主小RNA介导的防御机制(Singhetal., 2012; Karamipouretal., 2019)。

2.2 RanGTP-RanGDP循环

Ran与Kap之间的相互作用调节货物蛋白的运输，Ran与GDP或GTP组成不同形式的Ran蛋白穿梭于核膜两侧。RanGDP主要分布在细胞质中，RanGTP主要分布在细胞核中，在核膜两侧形成RanGTP浓度梯度决定核质转运的方向(Quimby and Dasso, 2003)。在RanGTP与RanGDP循环及核质转运中，Kap与细胞质中的货物蛋白结合进入细胞核内，再与RanGTP结合释放货物蛋白，Kap-RanGTP复合物再次进入细胞质循环；核输出时，RanGTP和货物蛋白分别结合Kap，在穿过NPC后，RanGTP在细胞质中水解成RanGDP，导致复合体的解体，释放出货物蛋白。细胞质中RanGAP激活RanGTPase水解RanGTP，产生的RanGDP通过专用的NTF2转运入核，RanGDP在细胞核内的Ran鸟嘌呤-核苷酸交换因子(Ran guanine-nuclear exchange factor, RanGEF)以及调控染色体浓缩调节因子(Regulator of chromosome condensation 1, RCC1)促进下与GTP转化为RanGTP及GDP。RanGTPase系统为货物蛋白结合和释放的主动控制提供核质转运周期中唯一的能量输入，这种RanGTP-RanGDP的不同区域循环也是RanGTP核质内外浓度梯度差产生的主要原因(Weis, 2003; Mosammaparast and Pemberton, 2004; Fanetal., 2011; Hampoelzetal., 2019)。

2.3 核转运受体

离子和小分子物质包括能被FG-Nup识别并互作的小分子蛋白质可以通过扩散穿过NPC，疏水残基以及带正电荷的精氨酸残基等具有显著的促进转运效果(Timneyetal., 2016; Freyetal., 2018)。而生物大分子的核质穿梭受限于体积与分子量的大小。一般直径小于5nm或者分子量小于40 kDa的蛋白质也可以自由通过NPC，分子量大于40 kDa的蛋白质及一些RNA的转运需要依赖于核转运受体蛋白Kap的协助。Kap属于高度保守的Karyopherin-β(Kapβ)超家族，不同物种之间Kap的数量也不等，例如在酿酒酵母中存在14种Kap，而哺乳动物中存在20种以上的Kap(Gorlichetal., 1997; Tessieretal., 2019)。Kap分子量范围在90～145 kDa, Kap包含一个N端结构域用于结合RanGTP，并可以直接与NPC中的Nup相互作用。Kap可分为核输入受体蛋白(Importin)与核输出受体蛋白(Exportin)，通过识别货物蛋白的核输入信号(Nuclear localization signal, NLS)或核输出信号(Nuclear export signal, NES)直接与底物蛋白相互作用。Kap也可通过接头蛋白(Adaptor protein)识别底物，将底物运送进细胞核或运输出细胞核(Mosammaparast and Pemberton, 2004; Xuetal., 2010)。

核输出因子(Nuclear export factor, NXF)是另一类保守的核转运因子，NXF主要将未成熟的mRNA前体复合物及病毒的RNA转运出细胞核，NXF的功能依赖于NXF与NTF2-related export protein(NXT)的异源二聚体结合(Blacketal., 1999)。NXF与典型的核输出受体相似，能识别FG重复序列并与相关Nup相互作用，从而介导mRNA复合体的出核转运(Izaurralde, 2002)。在黑腹果蝇DrosophilamelanogasterS2细胞中，NXF1缺失时，无内含子与剪切体的poly(A)+ mRNA无法运输出细胞核(Heroldetal., 2001)。利用RNA标记技术发现NXF2与NXF3具有介导mRNA的核输出活性，但在内源性mRNA底物核输出中的功能尚不明确(Heroldetal., 2000; Yangetal., 2001)。此外，在酵母等真核生物中，Mtr2p、Yra1p、EJC、Nab2p、Sac3p、Gle2p等蛋白被报道参与RNA转运出核过程的不同阶段，具体蛋白功能详见(Erkmann and Kutay, 2004)。

2.3.1Importin介导的入核转运

在Kap-RanGTP转运模型中，大分子蛋白质主动运输进入细胞核，需要含有富含碱性氨基酸NLS作为识别信号，目前研究最多的是经典型核定位信号(classical NLS, cNLS)，此外还有诸多类型的核定位信号，包括空间型核定位信号、隐秘型核定位信号和多分型核定位信号等。典型的cNLS是猿猴病毒SV40大T抗原上一段单分型cNLS(PKKKRKV)及核蛋白上一段双分型cNLS(KRPAATKKAGQAKKKK)，根据这些特点建立起NLS预测公式(表1)(Kalderonetal., 1984; Robbinsetal., 1991; Marforietal., 2011)。Importin α又称为Karyopherin α，Importin β又称为Karyopherin β，具有cNLS的货物蛋白与Importin α的犰狳重复(Armadillo repeat)序列结合，Importin α的N端识别Importin β的结合域(Importin β binding domain, IBB)并结合，形成Cargo-Importin α-Importin β复合体，经NPC中的FG-Nup识别后被胞质环纤维推入中心通道，进入细胞核后RanGTP与Importin β结合将货物蛋白从复合体中释放出来，完成货物蛋白转运入核(Contietal., 1998; Goldfarbetal., 2004; Kimura and Imamoto, 2014)。蛋白质入核过程如图1-A所示。在透化细胞中，Importin β在没有携带Importin α或Cargo且无外源能量时，又能以不依赖于Ran循环的方式转运进细胞核(Koseetal., 1997)。黑腹果蝇中主要存在三种Importin α(Importin α1、Importin α2和Importin α3)，三者相互之间同源性在42%～46%之间，Importin α1和Importin α2突变体配子存在缺陷，Importin α3突变导致幼虫在1龄或2龄期间死亡(Goldfarbetal., 2004; Ratanetal., 2008)。

2.3.2Exportin介导的出核转运机制

Exportin介导的出核转运机制与Importin介导的入核转运机制稍有不同，exportin识别的货物蛋白密集富含亮氨酸(Leu)等疏水性氨基酸的NES。经典型NES最早是从人类免疫缺陷病毒I型(Humanimmunodeficiencyvirustype1, HIV-1)的REV蛋白上鉴定而来(Meyeretal., 1996)，目前已经在超过300种蛋白中鉴定到NES序列，如转录因子、核糖核蛋白和病毒蛋白等，依据这些NES特点得到一个较为宽泛的NES典型特征序列模式：Φ-X2-3-Φ-X2-3-Φ-X-Φ(Φ为L/I/V/F/M，X代表任意氨基酸)(表1)(la Couretal., 2004)。与cNLS不同，NES的预测经常不准确，NES能以氮端-碳端或碳端-氮端的方向结合染色体维持蛋白(Chromosomal region maintenance, CRM1)，使得NES具有多样性(Fungetal., 2017)。三元复合物Cargo-Exportin-RanGTP经NPC从细胞核转运至细胞质中，Ran结合蛋白(Ran binding protein, RanBP)中含有NES及Ran结合域的RanBP1将RanGTP从三元复合体中解离释放出来，RanGAP水解RanGTP后释放货物蛋白完成蛋白质的出核转运(图1-B)(Fukudaetal., 1997; Floer and Blobel, 1999; Koyama and Matsuura, 2010)。

图1 核质转运示意图

表1 NLS和NES模序的典型特例及其代表性序列

3 真核生物核输出途径及其细胞功能

RNA的核输出途径主要通过NXF-NXT转运出核，然而近年发现多种不同的exportin也能介导各类RNA的核输出，exportin的“货物”更加多样。虽然一些小分子的蛋白能自由通过NPC，但是一些与FG-Nup亲和力较高的小分子蛋白能更高效快速地通过NPC，这表明一些小分子蛋白能通过FG-Nup或exportin出核，实现更快的出核转运速率。因此，本章仅介绍各种exportin的功能及这些exportin典型的货物蛋白。

exportin在高等真核生物中普遍存在，目前在酵母、果蝇及人类细胞中已发现的核输出受体共有7类，包括XPO1(也称CRM1/EMB1)、XPO2(也称CSE1/CAS)、XPO4、XPO5、XPO6、XPO7和XPOt等(Kimura and Imamoto, 2014)。众多exportin分别协助不同类型大分子的核质转运，CRM1是最主要的核输出受体蛋白，包括昆虫病毒蛋白、生长调节蛋白及肿瘤抑制因子等绝大多数需要出核转运货物蛋白经由CRM1途径介导出核，Leptomycin B(LMB)及一些烷基化试剂能与CRM1结合并抑制这一途径(Kudoetal., 1998; Kangetal., 2006; Hutten and Kehlenbach, 2007)。其它的几个核输出受体研究较少，Cse1/CAS主要介导Importin α的出核，并参与染色体的分离，是有丝分裂中细胞周期蛋白B降解所必需的(Scherfetal., 1996)。CAS还是几种增殖激活蛋白、转录因子、癌基因和肿瘤抑制基因产物如p53和BRCA1的核输出所必需的(Behrensetal., 2003)。xpo4也是一种肿瘤抑制基因，与人类肝癌密切相关。XPO4能双向转运，介导真核翻译起始因子eIF5A及转录因子SMAD3的出核，转录因子Sox家族成员依赖高迁移框结构(High-mobility group, HMG)被XPO4识别互作并介导入核(Lipowskyetal., 2000; Kurisakietal., 2006; Zhangetal., 2014)，xpo4敲除时致使胚胎干细胞中转录因子Sox表达降低，向内胚层分化，同时抑制神经外胚层的分化(Sangeletal., 2014)。XPO5能转运细胞核内的pre-miRNA至细胞质，翻译延长因子eEF1A能通过氨酰tRNA间接结合至XPO5出核。XPO5能介导tRNA及腺病毒RNA的出核，并被证实与RNA结合蛋白STAU2、白介素增强子结合因子ILF3的出核相关(Bohnsacketal., 2002; Gwizdeketal., 2003; Gwizdeketal., 2004; Macchietal., 2004)。XPO6在前纤维蛋白(Profilin)的协助下，将细胞核内的肌动蛋白转运至细胞质中，XPO6是Profilin-Actin复合物的唯一的出核载体，xpo6基因缺陷的果蝇突变体是隐性致死的(Perrimonetal., 1989; Stuvenetal., 2003; Fioreetal., 2017)。XPO7(RanBP16)也是一种具有双向转运功能的Kap之一，XPO7对血细胞的红系分化及去核是必要的(Hattangadietal., 2014; Aksuetal., 2018)。免疫分析及亚细胞定位分析表明XPO7多为信号通路中的负调控因子，能与Smyd3、Sufu、MetAP1和Sestrin2等货物蛋白相互作用并转运出核(Aksuetal., 2018)。质谱分析表明XPO7能介导eIF1、eIF4AI、p50RhoGAP、14-3-3σ以及逆转运复合物(Retromer)中Vps35、Vps26和Vps29亚基的出核转运。不同于CRM1识别的NES，eIF1及p50RhoGAP等货物蛋白以富含正电荷氨基酸残基信号被XPO7识别，而且亲和力较低(Haftetal., 2000; Mingotetal., 2004)。XPOt依赖于与RanGTP的结合，双向穿梭于NPC，主要与tRNA形成复合体出核。XPOt识别成熟的、正确折叠的tRNA，与tRNA的二氢尿嘧啶环(DHU loop)、氨基酸臂和TψC环等多个位点密切结合，tRNA的三级结构破坏后出核转运受阻碍(Artsetal., 1998; Kuerstenetal., 2002; Cooketal., 2009)。但是昆虫中缺乏XPOt的同源物(Lippaietal., 2000)。一些双向转运蛋白也具有核输出功能，其中Importin13是典型的双向转运蛋白，介导Mago-Y14二聚体、糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GR)、泛素结合酶9(Ubiquitin conjugating enzyme 9, Ubc9)等蛋白的核输入，Importin13也是eIF1A、eIF4G2和高迁移率蛋白HMG20A的核输出受体蛋白(Mingotetal., 2001; Bonoetal., 2010; Fatimaetal., 2017; Baadeetal., 2018)。在果蝇幼虫中，Importin13与突触稳态间接相关，影响神经肌肉接点处突触前膜神经递质的释放，可能控制视觉光转导级联过程(Giagtzoglouetal., 2009)。

4 昆虫细胞中核输出现象及其功能

昆虫的生命活动中，生殖发育、代谢循环和免疫反应等各种生理活动依赖于不同基因的有序表达及信号转导通路，这些途径都需要相应的激活因子进行核质穿梭或者转录出的mRNA、miRNA、piRNA等各种RNA的核输出。高等真核生物细胞分裂时，细胞核与细胞质的内容物会短暂的混合，回到间期后需要重新分离，如肌动蛋白等需要在完成核膜重构后从细胞核内分离出去，出核过程需要XPO6的协助(Stuvenetal., 2003)。昆虫各项生命活动与核质转运具有紧密的联系，核质转运对于维持和调控昆虫生命活动具有不可或缺的作用。转化生长因子β(Transforming growth factor β, TGF-β)是调节细胞增殖、分化和凋亡的蛋白(Upadhyayetal., 2017)，如TGF-β信号通路的下游转录因子Smad与Wnt信号通路中下游核受体β-Catenin需要依赖于RanBP3促进转录因子的出核调控信号通路，Smad系列蛋白的核质穿梭依赖不同途径的核输出受体蛋白的协助，Smad3的核输出由XPO4介导(Daietal., 2009)。果蝇缺氧诱导因子α蛋白Sima依赖NLS和NES反复地快速核质穿梭响应细胞缺氧状态(Romeroetal., 2008)。细胞周期素B(Cyclin B, CycB)在NPC通道中的CRM1/Emb和Nup62复合物介导下出核，核输出保证了细胞质中CycB-周期蛋白依赖性激酶1(Cyclin-dependent kinases 1, CDK1)的修饰和形成，这对雄性果蝇减数分裂的启动具有关键作用(Okazakietal., 2020)。昆虫卵母细胞的成熟、胚胎发育、生物钟和脂肪体功能调节中具有重要作用的Dorsal、Mago-nashi、TIMELESS和Hox蛋白等都需要依赖于核质穿梭行使调节功能，NES或NLS对这些蛋白是必不可少的(Micklemetal., 1997; Xylourgidisetal., 2006; Duffraisseetal., 2020; Caietal., 2021)。

4.1 RNA的核输出与昆虫的发育及抗病

昆虫发育中各种信号通路的转导及激活反应，都需要明确的激活因子进入细胞核，随后相应基因表达的RNA都必需通过核孔上核转运受体的协助离开细胞核。包括mRNA、piRNA和miRNA等各类RNA的成熟及调控过程离不开出核转运，不同转录因子和RNA出核所需的载体不同，主要但不止于CRM1的介导，还包括Cse1、XPO5和XPOt等在内多个核输出受体蛋白。

piRNA(Piwi-interactingRNA)是动物生殖细胞中一类22 nt左右的保守小RNA，在基础的免疫通路，在动物发育中起调控作用，保护细胞基因组抵御转座子带来的各种危害(Aravinetal., 2007)。piRNA最早是在果蝇中发现，果蝇卵巢里的piRNA也研究的最为广泛与深入。在果蝇的卵巢中，大部分的piRNA来源于双链簇，双链簇从两个基因组链产生piRNA。在果蝇卵巢的生殖细胞核中存在多个NXF转运体，其中依赖于NXF3的piRNA前体在NXT1的协助下，复合物通过核孔上的CRM1转运到细胞质中，随后piRNA簇的转录本进入类核周体nuage进行下一步加工(ElMaghrabyetal., 2019; Kneussetal., 2019)。

在蝇类和脊椎动物中，XPO5将pre-miRNA以pre-miRNA-XPO5-RanGTP复合物的形式输出到细胞质中并释放，pre-miRNA由Dicer进一步裂解，除此之外，XPO5还能维持pre-miRNA结构的稳定，XPO5过表达时能增强miRNA和Short hairpin RNA(shRNA)介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)(Zeng and Cullen, 2004; Yietal., 2005; Shcherbata, 2019)。CRM1可以介导成熟的miRNA进行核质穿梭，LMB的处理或crm1的敲除导致pri-miRNA在细胞核内积累，pri-miRNA至pre-miRNA的加工过程中断(Buessingetal., 2010)。RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)中包括Ago1、Ago2及RNA解旋酶(RNA helicase A, RHA)与CRM1有相互作用(Castanottoetal., 2009)，RHA也与NXF1有相互作用(Tang and Wong-Staal, 2000)，表明CRM1可能通过调节RISC复合物的核质转运，调节miRNA形成过程。

4.2 核输出与昆虫免疫反应

昆虫对病原体的细胞固有免疫反应的调控发生在多个水平上，包括核质转运水平，编码细胞防御蛋白的mRNA的核输出对于宿主对病原体入侵的反应是至关重要的。在病毒感染期间，特定的病原体相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs)被细胞内模式识别受体(Pattern recognition receptors, PRRs)识别。宿主识别病原体启动自分泌和旁分泌先天免疫信号，产生细胞因子和趋化因子，建立一种促炎、抗增殖的抗病原的状态(Kingsolveretal., 2013; Kussetal., 2013)。哺乳动物在面对病毒感染时，以干扰素家族的表达进行免疫反应，而昆虫在病毒感染时，很大程度上依赖RNAi抗病毒。也有学者发现在果蝇的抗病毒免疫反应中，IMD、Toll以及JAK/STAT均在不同程度上发挥了不同免疫作用(Lemaitre and Hoffmann, 2007; Herrera and Bach, 2019)，而这些免疫途径涉及的穿梭蛋白需要CRM1等介导核输出。果蝇的SOCS36E、去泛素化酶dUSP36-B亚型等信号通路的负反馈因子多含有NES能通过exportin途径出核进行负调控功能(Thevenonetal., 2009; Thevenonetal., 2020)。

昆虫的体液免疫主要以合成的凝集素、抗菌肽、酚氧化酶和溶菌酶等与异源病原物进行抗争，相应基因转录出的mRNA需要在核输出受体的协助下出核才能进一步剪切或翻译，而有些凝集素需要通过跨核膜运动维持动态平衡以响应免疫反应。以昆虫的体液免疫中凝集素(Lectin)为例，galectin基因在拟南芥Arabidopsisthaliana、果蝇、非洲爪蟾Xenopuslaevis和人类细胞中都存在。Galectin-3(Gal3)是一种多功能蛋白，调控细胞生长、细胞粘附、细胞间相互作用、细胞凋亡、血管生成和mRNA加工等多种生物学功能。Gal3在细胞核与细胞质间均有存在动态平衡，磷酸化的Gal3存在于细胞质，非磷酸化的Gal3存在于细胞核，Gal3的磷酸化及核输出过程对Gal3的生物活性是不可或缺的(Takenakaetal., 2004)。Gal3的C端含有NES，通过与CRM1的辅因子Nup98相互作用而不是直接与CRM1结合完成出核转运，其出核受到LMB的抑制(Haudeketal., 2010)。

4.3 病毒蛋白在昆虫细胞中的核输出

4.3.1病毒蛋白的核质穿梭

昆虫等节肢动物是一个天然的病毒库，被多种病毒感染，其中一些病毒对昆虫是致病性的，还有一些病毒是以昆虫为媒介传播给脊椎动物和植物。病毒自身并没有完整的细胞器结构，在进行增殖时需要利用宿主的细胞器合成所需的蛋白质和核酸。病毒在进化中产生一些短线性基序(Short linear motifs, SLiM)如NLS与NES，这些SLiM介导病毒蛋白与宿主核质转运蛋白相互作用，扰乱争夺宿主细胞核质转运通路(Daveyetal., 2011; Viaetal., 2015)。如甲型流感病毒(InfluenzaAvirus, IAV)的NP蛋白、人巨细胞病毒(Humancytomegalovirus, HCMV)的UL94蛋白和狂犬病毒(Rabiesvirus, RV)P蛋白等同时具有NLS与NES，在感染期间具有双向核质穿梭功能(Liuetal., 2012; Oksayanetal., 2012; Lietal., 2015)。这种穿梭现象对昆虫病毒复制周期来说也是必不可少的。双生病毒的C4蛋白、番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus, TYLCV)的CP蛋白是典型的穿梭蛋白，对于病毒在植物和昆虫细胞核内的积累是不可缺少的(Kuniketal., 1998; Meietal., 2018)。昆虫杆状病毒DNA聚合酶、LEF11等蛋白具有NLS，介导与宿主草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda的Importin α相互作用，转运入核，对病毒的增殖复制至关重要(Chenetal., 2017; Chenetal., 2021)。ME53和Ac34等不具有常规型NLS，但通过特殊的序列能能转运入核，对病毒的增殖复制也是至关重要的(Liuetal., 2016b; Qiuetal., 2017)。BmNPV的BRO蛋白具有经典的NES，利用家蚕的CRM1进行出核转运(Kangetal., 2006)。AcMNPV中有98个ORF含有符合预测通式的假定NES(Muetal., 2016)。

4.3.2病毒对宿主核输出的干扰

除痘病毒和藻病毒外，绝大多数DNA病毒选择在宿主的细胞核内进行复制，少量RNA病毒如慢病毒也具有跨越核膜的能力，在细胞核内复制增殖(Kussetal., 2013)。病毒无论是在宿主细胞质中复制还是在细胞核中复制，多会抑制宿主细胞mRNA的核输出以逃离宿主的免疫反应或争夺及破坏宿主的核质转运结构帮助病毒mRNA出核(Kussetal., 2013; Yarbroughetal., 2014)。BmNPV通过编码miRNA(bmnpv-miR-1)扰乱宿主依赖于RanGTP的XPO5介导的宿主miRNA合成途径，以此对抗家蚕的RNAi抗病毒反应(Singhetal., 2012)。AcMNPV在Sf9细胞核内复制组装核衣壳时，通过Ac34蛋白抑制宿主CRM1，阻碍肌动蛋白相关蛋白2/3(Actin-related protein 2/3, Arp2/3)通过CRM1途径出核，使Arp2/3滞留细胞核内协助病毒复制(Muetal., 2016)。干扰素(Interferon, IFN)通路也是病毒对宿主免疫反应的攻击位点，而不同病毒应对免疫反应的机制稍有不同，虫媒病毒中发现了多种干扰素拮抗蛋白，如黄病毒科中的非结构蛋白NS5抵抗宿主的抗病毒免疫反应，西尼罗病毒(WestNilevirus, WNV)NS5上NES的突变破坏病毒的复制(Lopez-Denmanetal., 2018)。基孔肯雅病毒(Chikungunyavirus, CHIKV)是一种经伊蚊传播的病毒，CHIKV通过nsP2蛋白促进宿主STAT1的核输出而抑制ISG的转录，从而扰乱宿主干扰素应答反应(Goertzetal., 2018)。但是这些虫媒病毒是否以同样的途径抑制介体昆虫的免疫反应还有待研究。

5 总结

核质转运是细胞生命活动中最频繁且重要的过程之一，细胞内遗传信息在不同时空上的选择性表达是真核生物的根本，核质转运过程几乎深入影响各种细胞活动。本文以果蝇等模式生物为例，简述核孔结构及核输出受体基础研究进展，介绍了核输出机制在一些昆虫的发育与免疫中发挥的作用。总的来说，昆虫细胞内几乎任何的代谢响应离不开核质转运基础，核质转运通路不仅是各类RNA与蛋白质穿梭的通道，实质也是基因时序表达的中途限速阀门，通过穿梭蛋白的入核/出核平衡进行激活/关闭相应基因的表达。

昆虫是天然的病毒库，如杆状病毒对昆虫是致病性的，而寨卡病毒Zikavirus、登革病毒Denguevirus等黄病毒科多个成员以蚊媒为主要载体进行传播，以及很多植物病毒多以烟粉虱Bemisiatabaci、飞虱和叶蝉等半翅目刺吸式口器昆虫为介体传播，这些病毒给医学卫生与作物病虫害管理方面带来巨大的威胁与挑战。病毒对宿主核输出机制的征用与病毒在介体/宿主细胞内的增殖复制密切相关，是病毒在介体/宿主体内传播的重要手段，以此方向可以作为开发新的抗病毒药物的重要靶点。以核输入受体为靶点的Imp α/β抑制剂伊维菌素(IVM)是目前使用最为广泛的抗寄生虫药物，IVM能显著抑制登革病毒在白纹伊蚊Aedesalbopictus体内的复制，控制登革病毒的传播。尽管CRM1的抑制剂LMB对人有很高的毒性，但也是研究核质穿梭中最重要的工具。核输出抑制剂Verdinexor(KPT-335)具有潜在的抗病毒作用，Selinexor(KPT-330)、Eltancxor(KPT-8602)和BIIB-100(KPT-185)等结构极其相似的药物相继进入抗肿瘤和抗病毒临床开发阶段。研究核输出机制使我们更加充分理解各种细胞活动过程中基因表达调控的逻辑，也包括病毒与宿主博弈过程中对宿主免疫途径的操控，这些对控制蚊媒病毒感染及杆状病毒杀虫活力的提高提供新的研究思路。