鳞翅目昆虫抗病毒免疫反应的研究进展

李 洁，李 洁，于乾龙，郑桂玲，张 彬，李长友

(青岛农业大学植物医学学院，山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛 266109)

鳞翅目昆虫种类繁多，是昆虫纲中的第二大目，其中许多种类是农业上的重要害虫，给农业生产带来巨大的经济损失；同时，一些种类如家蚕Bombyxmori和柞蚕Anthereapernyi等，是重要的资源昆虫。鳞翅目昆虫可被多种病毒感染，其中一些病毒是具有致病性的，常见的如杆状病毒科Baculoviridae的核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus, NPV)和颗粒体病毒(Granulovirus, GV)、呼肠孤病毒科Reoviridae的质型多角体病毒(Cypovirus)、二分DNA病毒科Bidnaviridae的二分浓核病毒(Bidensovirus)、囊泡病毒科Ascoviridae的囊泡病毒(Ascovirus)和痘病毒科Poxviridae的昆虫痘病毒(Entomopoxvirus)等。因此，昆虫病毒可以作为生物防治的重要手段来防治很多农业害虫，如棉铃虫Helicoverpaarmigera、甜菜夜蛾Spodopteraexigua、斜纹夜蛾Spodopteralitura、草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda和苹果蠹蛾Cydiapomonella等(Sosa-Gómezetal., 2020)，其优点是特异性强，安全无害，不易产生抗药性等特点，长期使用后可引起害虫群体病毒病的流行传播，从而实现害虫的可持续治理(李慧等, 2015; Kergunteuiletal., 2016)；另一方面，病毒感染家蚕等有益昆虫会造成严重的经济损失，预防和控制有益昆虫的病毒性疾病也十分重要(Jiang, 2021)。因此，研究鳞翅目昆虫与病毒的相互关系对于害虫的防治和益虫的利用都显得尤为紧迫，尤其是昆虫的抗病毒免疫研究。昆虫属于无脊椎动物，与高等脊椎动物相比缺少获得性免疫系统，不会对入侵的病毒产生特异的抗体，而是在与病毒的长期互作中形成了一套独特的先天免疫系统，主要是通过体液免疫和细胞免疫共同抵御病毒的入侵。在病毒与宿主的互作过程中，病毒可以劫持宿主的基因来进行自我增殖，同时病毒对其宿主产生的巨大选择压力，使其进化出各种抗性途径(Misofetal., 2014)。反之，多样化的抗病毒途径又激发病毒对宿主免疫产生了丰富的抑制或逃避宿主的免疫响应。因此，通过病毒与宿主昆虫之间的互作研究，可以深入了解鳞翅目昆虫抗病毒免疫途径的多样性。本文将针对鳞翅目昆虫对病毒入侵的防御、细胞免疫和体液免疫反应、抗病毒免疫途径及相关基因的功能、抗病毒免疫研究的制约因素等的研究进展进行综述，以期为害虫的生物防治和益虫疾病的防控提供理论依据。

1 昆虫对病毒入侵的防御

多数种类的鳞翅目昆虫病毒会随食物经口和消化道入侵中肠，病毒粒子需要通过围食膜和中肠上皮细胞，进而造成继发性感染，完成病毒的复制、组装和释放等过程。昆虫也进化出了一套抑制或阻断病毒入侵的方法，其中消化道在昆虫先天免疫防御中起着重要的作用，是抵御病毒的第一道天然屏障，下面主要介绍围食膜和中肠在防御病毒入侵过程中的作用。

1.1 围食膜的防御作用

围食膜(Peritrophic matrix, PM)是广泛分布于昆虫中肠内壁，处于中肠上皮细胞和肠道内容物之间的一层选择透过性膜，起到增加中肠润滑、促进食物消化、中和毒素等作用。围食膜由中肠前端一直延伸至后肠内。根据围食膜的形成方式可将其分为两类：一类由中肠细胞分泌，形成多层重叠的管状膜，称Ⅰ型围食膜，多见于鞘翅目、膜翅目、蜻蜓目、直翅目昆虫和鳞翅目幼虫中；另一类由中肠前端特殊细胞分泌出粘液，通过食道内褶与中肠之间环状裂缝的挤压形成Ⅱ型围食膜，常见于革翅目、等翅目、纺足目、部分鳞翅目和双翅目幼虫(Hegedusetal., 2019)。围食膜是由几丁质、蛋白质和多糖组成的复合物，几丁质构成围食膜的骨架，多数的蛋白质与糖结合以糖蛋白或蛋白多糖的形式存在，而糖是围食膜半渗透性以及致密性的主要因素(Yangetal., 2010)。

病毒能否入侵中肠上皮细胞，是病毒开始感染时首先要面对的问题之一。作为病毒同昆虫接触的第一道物理屏障，围食膜在保护昆虫免受病毒侵染方面发挥着重要的作用。围食膜的结构特性可以影响昆虫对病毒感染的敏感性，与敏感昆虫相比，抗性的梨豆夜蛾Anticarsiagemmatalis围食膜相对较厚，几丁质含量更高，与麦胚凝集素的结合能力更强(Levyetal., 2007; 2012)。

围食膜作为昆虫体内一道物理性保护屏障，其特殊的结构组成形式发挥着主要的生理功能。人为干扰昆虫围食膜正常的生理功能，可以达到控制害虫的目的。多种病毒增效因子可以通过不同方式与围食膜上特异位点结合或降解围食膜蛋白和几丁质，从而破坏围食膜的结构，可以促进病毒对昆虫的感染(Erlandsonetal., 2019)。例如，来自于颗粒体病毒的增效蛋白，是一种金属蛋白酶，能降解围食膜肠粘蛋白(Invertebrate intestinal mucin, IIM)，使围食膜结构受到破坏，帮助病毒粒子进入中肠细胞，加速病毒感染进程(Wang and Granados, 1997)。荧光增白剂可以竞争性地结合到几丁质上，导致围食膜蛋白与几丁质的解离，并能促进核型多角体病毒对宿主的侵染(Wang and Granados, 2000)。几丁质酶处理的围食膜常出现孔洞和缝隙，随着处理时间的延长，对围食膜的破坏程度也越大，可以明显加快核型多角体病毒对棉铃虫初孵幼虫的致死速度(刘文霞等, 2008)。以上研究均说明围食膜对病毒的入侵具有一定的防御作用。

1.2 中肠的防御作用

昆虫中肠是分泌消化酶、消化食物和吸收营养物质的重要场所，同时也是病毒入侵的作用靶标。中肠的组织结构、组成和生理功能也对病毒的入侵具有一定的防御作用。研究发现，随着龄期的增加，烟芽夜蛾Holiothisvirescens幼虫对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus, AcMNPV)感染的抗性不断增强，与4龄幼虫相比，5龄幼虫经口腔感染的进程要慢得多，抗性可能是由于中肠细胞的不同生理特性引起的，5龄幼虫后期的中肠细胞结构会随着发育向成虫细胞类型发生转变，中肠细胞可能在幼虫末期以较快的速度脱落(Kirkpatricketal., 1998)。舞毒蛾Lymantriadispar新蜕皮的4龄幼虫对舞毒蛾核型多角体病毒(Lymantriadisparmultiplenucleopolyhedrovirus, LdMNPV)的LD50低于蜕皮后2～3 d感染病毒的幼虫。此外，蜕皮后2～3 d感染的幼虫较新蜕皮感染的幼虫体内含有更多的黑化感染病灶，被感染的血细胞数量也减少(McNeiletal., 2010a; 2010b)。

中肠的组成也对病毒的入侵具有影响，通过比较家蚕对浓核病毒中国株(Bombyxmoridensovirus, BmDNV-3)抗性及感性品系的中肠蛋白质表达谱，鉴定出糖基转移酶(Glycosyltransferase)、糖基转移酶-S(GlcAT-S)、21.5 kDa小热休克蛋白(21.5 kDa small heat shock protein)、V-ATP酶(Vacuolar ATP synthase)和精氨酸激酶(Arginine kinase)等5种蛋白在抗性品系秋丰中的表达量均高于感性品系华八35，而糖基转移酶和糖基转移酶-S仅在抗性品系中存在，提示它们可能是与抗浓核病毒有关的蛋白(包方等, 2007)。草地贪夜蛾对AcMNPV经口感染具有高度抗性，但对血腔内的芽生病毒(BV)极敏感。研究表明，AcMNPV的包埋型病毒粒子(ODV)无法在草地贪夜蛾中肠细胞内轻易建立原发感染，这是经口抗性产生的主要原因，病毒的经口感染可能受到病毒粒子与昆虫中肠结合能力的影响。相比于草地贪夜蛾核型多角体病毒(Spodopterafrugiperdamultiplenucleopolyhedrovirus, SfMNPV)，AcMNPV ODV与草地贪夜蛾幼虫中肠细胞的亲和力降低，仅为SfMNPV的15%。SfMNPV ODV可与AcMNPV ODV未结合的中肠细胞受体结合，这可能有助于其提高其启动感染的能力(Haas-Stapletonetal., 2005)。

另外，从家蚕的消化液中分离出家蚕红色荧光蛋白(Red fluorescent proteins, RFPs)、家蚕脂肪酶-1(Bombyxmorilipase-1, Bmlipase-1)、家蚕丝蛋白酶-2(Bombyxmoriserine protease-2, BmSP-2)、可溶性NADPH氧化还原蛋白(A soluble NADH-oxidoreductase-like protein, BmNOX)、家蚕胰蛋白酶(Bombyxmoritrypsin, Bmtryp)等多种抗病毒因子，对病毒入侵起到不同程度的抗性作用(郭望等, 2018)。

2 昆虫的细胞免疫和体液免疫

当病毒突破宿主昆虫中肠屏障后，进入到体腔时，昆虫的免疫系统可对外来的病原微生物或异物进行防御。昆虫的免疫系统可分为细胞免疫和体液免疫。细胞免疫主要通过浆细胞、粒细胞和拟绛色细胞等血细胞参与的吞噬(Phagocytosis)、集结(Nodulation)和包囊(Encapsulation)等过程清除异物(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。体液免疫主要是通过Toll、Imd、JAK-STAT等信号通路产生抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)等效应分子和由原酚氧化酶(Prophenoloxidase, ProPO)等一系列酶参与的凝结(Coagulation)和黑化反应(Melanization)(Christensenetal., 2005)。虽然将昆虫天然免疫反应分为细胞免疫和体液免疫两种，其实，在抵御病原物侵染的过程中，细胞免疫和体液免疫实际上是相互交叉，紧密联系在一起的。二者共同作用，通过对病原体识别、信号转导途径及效应机制等过程完成对病原物的杀灭和清除。

在昆虫天然免疫反应中，首先由模式识别蛋白(Pattern recognition proteins/receptor, PRPs)识别并结合病原物表面特有的模式分子(Pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)。模式识别蛋白通常分布在脂肪体细胞以及血淋巴细胞表面，或者游离在昆虫的血淋巴中，已经鉴定的模式识别蛋白主要有β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan recognition protein, βGRP)或革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins, GNBPs)、肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)、类免疫球蛋白(Hemolin)、C型凝集素(C-type lectins)等，不同的模式识别蛋白具有不同的结构和功能，可以识别并结合不同的PAMPs(Jiangetal., 2010; Hughes, 2012)。当外界病原物进入昆虫体内被模式识别受体蛋白识别后，继而一系列包括丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂在内的级联激活反应，以及Toll、Imd、JAK-STAT等信号转导通路被激活，来调控昆虫的体液免疫和细胞免疫(Christensenetal., 2005)。

免疫效应分子主要包括抗菌肽、黑色素、活性氧等，负责对病原物的杀灭和清除。抗菌肽是一类小分子量的阳离子肽，具有广谱抗菌活性，针对不同类型的病原物，抗菌肽的产生机制也不尽相同。昆虫体内主要是由Toll和Imd等途径通过激活不同转录因子，调控不同抗菌肽基因的表达而参与昆虫体内的天然免疫反应(张明明等, 2012)。黑化反应是由丝氨酸蛋白酶级联调控的，丝氨酸蛋白酶裂解和激活原酚氧化酶，形成有活性的酚氧化酶，然后催化酚类物质(如酪氨酸)氧化成苯醌类非芳香环化合物，然后再聚合形成黑色素。黑色素合成和沉积的结果会导致伤口部位变黑，是对抗感染的重要防御手段，它可以包裹和隔离病原体，类似于脊椎动物的凝血系统(Pophametal., 2004)。酚氧化酶同时能激活体液免疫和细胞免疫，发挥抗病毒作用(Luetal., 2014; Yietal., 2014)。此外，黑化反应的中间体可参与活性氧的生产，活性氧是杀死病原微生物的毒剂(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。

关于昆虫天然免疫系统的研究和描述大部分来自于模式昆虫果蝇，但一些报道显示，鳞翅目昆虫对病毒具有相似的免疫防御系统。美洲棉铃虫Helicoverpazea和烟芽夜蛾同属于鳞翅目夜蛾科，但美洲棉铃虫对AcMNPV的敏感性比烟芽夜蛾低1 000倍，是由于AcMNPV感染美洲棉铃虫能够激活宿主的黑化和包囊反应，从而降低病毒在血淋巴中的滴度并抑制感染进程，而在烟芽夜蛾中的这一免疫途径并不活跃(Trudeauetal., 2001)。海灰翅夜蛾Spodopteralittoralis对AcMNPV感染也具有高度的抗性，由于能够有效地将病毒包裹在成气管细胞中，病灶在蜕皮过程中被清除，从而消除了感染(Rivkinetal., 2006)。研究表明细胞免疫和体液免疫在昆虫的抗病毒过程中发挥重要作用，这个过程涉及多条免疫途径，详见下文。

3 鳞翅目昆虫的抗病毒免疫途径

3.1 RNAi途径

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种存在于细胞内进化较为保守的基因沉默机制，在调节基因表达和抵抗病毒侵染中发挥重要作用，是昆虫中重要的抗病毒免疫途径(Kingsolveretal., 2013; Chejanovskyetal., 2014; Carissimoetal., 2014;McFarlaneetal., 2014; Zografidisetal., 2015; Sweversetal., 2020)。RNAi是指外源或内源的dsRNA(Double-stranded RNA)特异性的诱导其同源基因转录后的沉默，病毒dsRNA的存在会诱发昆虫体内的抗病毒RNAi反应。在昆虫中，已经检测到病毒衍生的不同类型的小RNA，即siRNA(Small interfering RNA)、miRNA(Micro-RNA)和piRNA(Piwi-interacting RNA)(Morazzanietal., 2012; Aguiaretal., 2015)。研究发现siRNA在昆虫的抗病毒免疫中起主要作用，病毒的dsRNA被Dicer家族的RNA酶切割成21～23 nt的siRNA，siRNA中的一条链被Argonaute(Ago)家族蛋白复合体识别并加以修饰，形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)，在siRNA的引导下驱动病毒RNA的降解(Kimetal., 2009)。

在鳞翅目昆虫中，将RNAi途径中的关键基因过表达可以帮助细胞免受病毒感染(图1，表1)。例如，在粉纹夜蛾TrichoplusianiHigh Five细胞中过表达Dicer-2和Argonaute-2(Ago-2)可以提高细胞对蟋蟀麻痹病毒(Cricketparalysisvirus, CrPV)的防御能力。反之，通过RNAi沉默Dicer-2和Ago-2导致细胞中的拟黄斑潜伏病毒(Macula-likelatentvirus, MLV)的转录水平显著升高(Santosetal., 2018)。在家蚕幼虫中过表达Ago-2和Dicer-2，可以提高家蚕对dsRNA的敏感性(Youetal., 2020)。在转基因家蚕中过表达以家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus, BmNPV)、家蚕质型多角体病毒(Bombyxmoricypovirus, BmCPV)和家蚕二分浓核病毒(Bombyxmoribidensovirus, BmBDV)等病毒基因为靶标的dsRNA，可以显著降低上述病毒的增殖和家蚕感染病毒后的死亡率(Jiangetal., 2013; 2017; Sunetal., 2018)。Jayachandran等(2012)在美洲棉铃虫脂肪体细胞(HzFB)中，通过RNAi沉默Dicer-2的表达，成功的提高了棉铃虫核多角体病毒(Helicoverpaarmigeranucleopolyhedrovirus, HaNPV)在细胞中的增殖，表明Dicer-2直接参与棉铃虫的抗病毒免疫。Karamipour等(2018)用AcMNPV感染Sf9细胞后发现Dicer-2和Ago-2基因表达水平上调，同时发现Sf9细胞中有大量细胞中siRNA匹配到AcMNPV上。次年，Karamipour等(2019)又发现，通过RNAi将Dicer-1和Ago-1沉默后，提高了AcMNPV在Sf9细胞中的增殖，同时降低了miR-184的表达水平，表明Dicer和Ago基因在AcMNPV侵染Sf9细胞中参与了抗病毒免疫。另外，宿主编码的miRNA可以抑制病毒的增殖，如Bmo-miRNA-2819通过下调BmNPV的ie-1基因的表达来抑制病毒的增殖(Wuetal., 2019)。与siRNA和miRNA不同，piRNA来源于单链RNA前体，piRNA在模式昆虫黑腹果蝇Drosophilamelanogaster、埃及伊蚊Aedesaegypti中有明显的抗病毒免疫作用，但是在鳞翅目昆虫中piRNA的抗病毒免疫作用尚不清楚(Kolliopoulouetal., 2019)。

图1 鳞翅目昆虫免疫信号通路(RNAi、Imd、STING、Toll、JAK-STAT、凋亡)及免疫相关基因

3.2 细胞的自噬及凋亡途径

很多研究表明，病毒侵染细胞后能诱导细胞的自噬(Autophagy)和凋亡(Apoptosis)。自噬和凋亡是决定细胞命运的关键途径，在抗病毒免疫中发挥着非常重要的作用。细胞自噬是宿主为抵抗外界干扰，维持能量代谢平衡的一种发生在生物体内的相对保守的过程。近年来，自噬被认为是昆虫中一种重要的抗病毒机制，当病毒感染细胞后，诱导自噬信号的释放，促使自噬产生(Shellyetal., 2009; Nakamotoetal., 2012)。与自噬相关信号分子有III型磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase, PI3K)复合体、ULK-Atg13-FIP200-Atg101复合体、跨膜蛋白Atg9、跨膜蛋白Atg14、Atg12-Atg5共轭系统和Atg8/LC3共轭系统(Suzukietal., 2007; Urman and Ktistakis, 2010; Yinetal., 2016)。PI3K-Akt途径可以对自噬进行负调控，PI3K-Akt途径的激活可以提高TOR(Target of rapamycin)的表达水平，TOR通过磷酸化作用抑制ULK复合物的激活和Atg蛋白的表达，最终抑制细胞自噬的发生(Wongetal., 2013)。在黑腹果蝇中，利用RNAi沉默Atg5基因的表达，可以抑制自噬过程，导致S2细胞和黑腹果蝇体内水泡性口炎病毒(Vesicularstomatitisvirus, VSV)产量的增加。而利用RNAi沉默Akt的表达，可以促进自噬过程，降低虫体内病毒的产量(Shellyetal., 2009)。

细胞凋亡是一种在基因控制下的细胞程序性死亡，可以由病毒侵染诱导发生，在机体的免疫中发挥重要作用(Ikedaetal., 2013)。在病毒感染早期，细胞凋亡不仅可以抑制病毒的复制，也可以促进吞噬细胞对感染细胞的清除，从而降低或阻止病毒在宿主体内的传播(Settles and Friesen, 2008; Liuetal., 2013; Byersetal., 2016)。用BmNPV、甜菜夜蛾核型多角体病毒(Spodopteraexiguamultiplenucleopolyhedrovirus, SeMNPV)和黄杉毒蛾核多角体病毒(Orgyiapseudotsugatamultiplenucleopolyhedrovirus, OpMNPV)分别感染舞毒蛾Ld652Y细胞均会诱导其凋亡(Ishikawaetal., 2003)；AcMNPV感染斜纹夜蛾细胞早期，斜纹夜蛾核型多角体病毒(Spodopteralituramultiplenucleopolyhedrovirus, SpltMNPV)和大豆夜蛾核型多角体病毒(Anticarsiagemmatalismultiplenucleopolyhedrovirus, AgMNPV)感染的宿主细胞早期均会诱导宿主细胞凋亡(Zhangetal., 2002; Ishikawaetal., 2003)，上述结果表明在病毒感染早期，细胞启动凋亡来抑制病毒的增殖和扩散。研究发现，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)参与病毒感染引发的细胞凋亡，在细胞抗病毒免疫中发挥重要作用(Shi, 2002)(图1，表1)。病毒感染家蚕抗性品系后，家蚕细胞14-3-3基因的表达量升高，降低了细胞凋亡抑制因子Bcl-2基因的表达，从而促进线粒体中细胞色素C释放到细胞质，细胞色素C触发Caspase级联反应，BmCaspase1的表达量上升进而诱导细胞凋亡(Rosenquist, 2003)。BmNPV感染家蚕后，家蚕中Bmcaspase-1的表达水平显著升高，并且其在抗BmNPV的家蚕品系中表达水平被上调(Wangetal., 2017)。此外，AcMNPV侵染甜菜夜蛾幼虫时导致SeCaspase-6的表达水平显著上调(表1)(Yuetal., 2020)。综上所述，Caspase在杆状病毒感染鳞翅目昆虫过程中起重要作用。

3.3 免疫信号转导通路

导致细胞基因表达变化的信号转导途径是先天抗病毒免疫的另外一个重要组成部分。免疫信号转导是生物体通过对外源病原物进行识别，将识别信号放大，激活免疫效应因子的过程。研究表明，鳞翅目昆虫对病毒入侵的免疫应答主要涉及4种免疫信号转导通路，分别是Toll、Imd、JAK-STAT(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription)和STING(Stimulator)通路。

3.3.1Toll信号通路

Toll信号通路不仅能够介导宿主对病原微生物感染的防御，快速产生相应的抗菌肽(Chowdhuryetal., 2019)，在细胞的免疫应答中起关键作用(Hillyer, 2016; Yamamoto-Hino and Goto, 2016)。Toll信号通路的激活包括βGRP、β-1,3-葡聚糖结合蛋白(β-1,3-glucan binding protein, βGBP)对病原物的识别、配体Späetzle(Spz)的活化、细胞膜上Toll受体的结合与激活，调控下游作用基因的转录，快速调节抗菌肽的合成与分泌(Wangetal., 2007)。当Toll受体的胞外功能区与活化的Spz配体结合而具有活性时，它的胞内功能区会与髓样分化因子(MyD88)结合，随后MyD88再与Tube(连接蛋白)结合，然后将信息传递给Pelle激酶，最后导致负调节因子Cactus的水解，使转录因子Dorsal/Dif从细胞质向细胞核转移，调节下游基因的表达及抗菌肽的产生(Valanneetal., 2011)。

Toll受体在昆虫的先天免疫中如同一个监视器，能够监视和识别各种病原物表面特有的模式分子，在昆虫抵御外源入侵机体中起着重要作用(Ramirez and Dimopoulos, 2010; Anthoneyetal., 2018)。利用草地贪夜蛾囊泡病毒(Spodopterafrugiperdaascovirus, SfAV)侵染草地贪夜蛾的幼虫，Toll通路的βGRP、Toll、Spz、Pelle的表达水平显著升高，表明SfAV感染激活了Toll信号通路(Zaghlouletal., 2020)。BmNPV感染家蚕细胞也可以激活Toll信号转导通路，抗BmNPV的家蚕细胞中BmToll10-3的转录水平显著升高，进而诱导一系列抗菌肽和抗病毒分子的产生，参与抗病毒的调控(李喜升, 2016)。另外，利用BmBDV感染家蚕幼虫，发现Toll通路上的Spz基因的表达水平显著升高，表明其对BmBDV有免疫应答(孔鸣, 2018; Kumaretal., 2019)。孔鸣(2018)研究发现，家蚕抗性品系NB和华八BC8中βGRP的表达量显著高于感性品系306中的表达量。上述研究结果表明Toll信号通路参与了鳞翅目昆虫的抗病毒免疫反应，但其具体机制还需进一步研究。

3.3.2Imd信号通路

昆虫Imd信号通路是调控昆虫体液免疫反应的重要信号转导途径之一，类似于哺乳动物的肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor, TNFR)信号途径(Tanjietal., 2007)。昆虫Imd通路在果蝇中研究较为透彻，果蝇中主要介导革兰氏阴性菌和部分病毒的免疫响应(Ramirezetal., 2019)，革兰氏阴性菌的表面存在DAP-型肽聚糖等病原相关分子，通过含跨膜结构域的肽聚糖识别蛋白PGRP-LC或胞外的PGRP-LE对病原物进行识别，且造成PGRP-LC或PGRP-LE构象的改变(Kanekoetal., 2006)，将信号传递给接头蛋白IMD并将其活化(Choeetal., 2002)。激活后的IMD与转化生长因子β激活激酶1(Transforming growth factor β-activated kinase, TAK1)发生作用，随后TAK1将免疫信号传递给IκB激酶(Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)，激活Relish蛋白(Leulieretal., 2002; Silvermanetal., 2003)，Relish蛋白的部分区域进入细胞核诱导下游抗菌肽的表达(Tanakaetal., 2008)。

Imd通路已经被证明在模式昆虫果蝇和蚊子的抗病毒免疫中发挥作用(Lamiableetal., 2016; Mussabekovaetal., 2017; Ramirezetal., 2019)。在家蚕中(图1，表1)，肽聚糖识别蛋白PGRP-S2是一种分泌蛋白，可以识别BmCPV的特定成分，将信号传递给Imd通路的下游分子。PGRP-S2过表达后增加了BmImd，BmRelish和AMPs基因的表达，同时降低了家蚕感染BmCPV后的死亡率(Zhaoetal., 2018)。此外，BmPGRP2-2基因也参与了家蚕的抗BmNPV的免疫反应，利用BmNPV感染敲除BmPGRP2-2后的家蚕，显著降低了家蚕BmN4-SID1细胞系和家蚕DZ幼虫中的BmNPV的增殖和死亡率，反之，在家蚕细胞系中过表达BmPGRP2-2显著提高了BmNPV的产量。此研究还发现，BmNPV感染家蚕可以诱导BmPGRP2-2的表达量升高，通过抑制PI3K/Akt信号通路来抑制细胞的凋亡，从而促进BmNPV的增殖(Jiangetal., 2019)。另外，利用BmBDV感染家蚕初孵幼虫144 h后，其体内PGRP-LE、PGRP-LC和PGRP-LB的表达量极显著升高，亦表明BmBDV感染激活了Imd通路(Kumaretal., 2019)。上述结果表明，Imd通路参与了鳞翅目昆虫对病毒的免疫防御，但是Imd通路在鳞翅目昆虫抗病毒免疫中的具体机制尚不清楚。

3.3.3JAK-STAT信号通路

JAK-STAT是一条由配体识别激活的免疫信号通路，是昆虫重要的抗病毒免疫信号转导通路。目前对昆虫JAK-STAT信号通路的研究主要集中在果蝇、蚊子和家蚕等昆虫中。在黑腹果蝇、埃及伊蚊免疫研究中发现：胞外配体Upaired(Upd)识别免疫信号后与跨膜受体Domeless(Dome)结合后，JAK-STAT信号通路被启动，激活Janus酪氨酸激酶Hopscotch(Hop)，导致STAT的磷酸化并形成二聚体转移到细胞核，然后二聚体结合至下游效应基因启动子的调控序列上，从而启动下游靶基因的转录表达进而发挥抗病毒作用(Hombría and Brown, 2002; Arbouzova and Zeidler, 2006)。细胞因子信号转导抑制因子SOCS(Suppressor of cytokine signaling)和PIAS蛋白(Protein inhibitor of activated STAT)是JAK-STAT通路上重要的转录调节因子(Betzetal., 2001; Robert and Cooney, 2002)。当Dome或Hop被RNA干扰后，埃及伊蚊更容易被登革病毒(Denguevirus, DENV)感染，而当负调节因子PIAS被抑制时，埃及伊蚊对DENV的抗性增强(Souza-Neto and Dimopoulos, 2009; Jupatanakuletal., 2017)。在果蝇中发现参与JAK-STAT信号通路的基因有Upd1、Upd2、Upd3、Hop和STAT92E等(Arbouzova and Zeidler, 2006)。在家蚕中也鉴定到Hop、STAT、SCOS和PIAS基因，但未鉴定到Upd和Dome基因(Wuetal., 2010)。同样，本课题组用AcMNPV侵染甜菜夜蛾细胞，发现不敏感细胞中Hop、STAT基因的表达量较敏感细胞显著升高，但在甜菜夜蛾基因组中亦未发现Upd和Dome两个基因，表明AcMNPV侵染激活了JAK-STAT通路，但是与果蝇、蚊子等昆虫的JAK-STAT通路不同，与病原物识别结合的基因不是Upd和Dome。在家蚕中BmHop编码的蛋白可能是一种JAK激酶，可以将BmSTAT转录因子磷酸化，进而激活靶基因的转录。另外有研究表明，BmNPV和BmBDV感染家蚕后，能检测到家蚕中肠中BmSTAT基因的表达量显著上升，家蚕黄斑类似病毒(Bombyxmorimacula-likevirus, BmMLV)感染家蚕也可以诱导BmSTAT的表达量轻微上调(Liuetal., 2015; Zhangetal., 2016)。孔鸣(2019)研究发现BmBDV感染家蚕后，BmSOCS-2在抗性家蚕品系华八BC7中的表达量显著高于敏感品系中的表达量，后又在家蚕卵巢细胞BmN中过表达BmSOCS-2，提高了细胞对BmNPV的抗性，证明了BmSOCS-2在抗BmNPV侵染的过程中发挥了重要作用。综上所述，家蚕的JAK-STAT信号通路被激活并参与到抗病毒的免疫反应中，在抗病毒防御中发挥重要作用。

3.3.4STING信号通路

STING是一个内质网常驻蛋白，是哺乳动物先天免疫中的重要信号传递因子(Ishikawa and Barber, 2008)。在cGAS-STING信号通路中，cGAS可以识别病毒DNA，与细胞内的ATP、GTP一起形成cGAMP，cGAMP将信号传递给STING，STING从内质网转移到近核区，并且可以磷酸化TBK1和IRF3，被磷酸化的IRF3进入细胞核，诱导β干扰素的产生，起到抗病毒免疫的作用(Wuetal., 2013; Wooetal., 2014)。

在家蚕中也存在STING介导的抗病毒信号通路(图1)，BmNPV感染家蚕可以诱导细胞合成cGAMP，cGAMP激活家蚕STING并使其发生核移位，STING与Dredd相互作用进而激活NF-κB转录因子，提高Relish的表达，诱导抗菌肽和抗病毒因子的表达，提高对BmNPV感染的抵抗力(Huaetal., 2018)。果蝇中STING的研究结论与家蚕一致，果蝇STING参与抗果蝇C病毒(DrosophilaCvirus, DCV)的免疫反应中，作用在Relish的上游，调控抗病毒因子Nazo的产生(Gotoetal., 2018)。此外，Martin等(2018)研究表明STING信号通路的抗病毒作用在进化上非常保守。

3.3.5其它免疫通路和基因

在昆虫与病毒的互作研究中，为了提高病毒在宿主体内的增殖，部分宿主的信号通路可以被侵染病毒所操控，如，原酚氧化酶、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路，且各信号通路之间不是孤立存在的，而是相互联系的(Jiang, 2021)。例如，杆状病毒侵染宿主可以激活原酚氧化酶信号通路，诱导Bmserpin2的表达进而抑制宿主的黑化反应(Toufeeqetal., 2019)；杆状病毒侵染也可诱导BmPGRP2-2的表达从而降低磷酸酶和张力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homolog, PTEN)的表达，增加PI3K/Akt的表达，最终抑制宿主细胞的凋亡和自噬(Leeetal., 2018; Jiangetal., 2019)；家蚕的病毒还可以通过调控BmSpry的表达来操控宿主的ERK信号通路(Jinetal., 2014)。另外，在果蝇、蚊子等模式昆虫中研究发现，Imd、Toll和JAK-STAT信号通路间也是相互联系的，从而对病原物形成特异性的免疫应答。例如，在果蝇中，Imd和Toll信号通路都可以激活细胞转录因子NF-κB，从而诱导抗菌肽的产生(Kimetal., 2009; Fressigné and Simard, 2018)；在埃及伊蚊中，当DENV侵染时，JAK-STAT信号通路的负调控因子PIAS被沉默后，发现Toll信号通路的Spz，部分抗菌肽和防御素的表达量被下调(Souza-Netoetal., 2009)。上述结果表明Imd和Toll信号通路，JAK-STAT和Toll信号通路是相互关联，除此之外siRNA通路和JAK-STAT通路之间，细胞凋亡通路与JAK-STAT之间通路也是相互联系的(Kingsolveretal., 2013)。但是，目前关于鳞翅目昆虫免疫通路之间相互关系的研究鲜有报道，值得深入研究。

除了免疫信号通路相关的抗病毒基因外，在鳞翅目昆虫中还有一些其它基因与昆虫的抗病毒相关(表1)。例如，在家蚕中，通过RNAi抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A(Ser/Thr protein phosphatase 2A, PP2A)，可增加BmNPV的复制。相反，通过过表达BmPP2A可显著抑制BmNPV的增殖(Huetal., 2020)。Selot等(2010)研究发现家蚕抗性品系Nistari中BmNOX(NADH-oxidoreductase-like protein)的表达量显著高于敏感品系CSR2中的表达量，并且家蚕Nistari品系对BmNPV感染表现出较强的抗性，此外，研究证明BmNOX蛋白在体外有很好的抗BmNPV的活性。在棉铃虫幼虫中，通过RNAi抑制Thioredoxin(Trx)和Thioredoxinreductase(TrxR)的表达，导致棉铃虫对HaMNPV感染的敏感性提高(Zhangetal., 2015)。上述研究表明BmPP2A和BmNOX参与了家蚕抗BmNPV的免疫反应，Trx和TrxR参与了棉铃虫的抗病毒免疫反应，但这些基因在其它鳞翅目昆虫中的抗病毒免疫情况尚不清楚，有待深入研究。

4 鳞翅目昆虫抗病毒免疫研究的制约因素

在鳞翅目昆虫的抗病毒免疫研究中，RNAi是重要的技术手段。然而，目前RNAi技术在害虫防治中的应用还存在一些问题，如有效靶基因的筛选和应用策略，鳞翅目害虫对RNAi的敏感性低(Garbuttetal., 2013; Limetal., 2016; Mamtaetal., 2017; Pengetal., 2018)以及dsRNA在环境中的不稳定性等。在Terenius等(2011)发表的“鳞翅目昆虫中RNAi应用情况”综述中，研究者发现在多种鳞翅目昆虫中，天蚕蛾科昆虫的RNAi效率相对较高。文章中共分析了鳞翅目昆虫中130个基因的RNAi效果，仅有38%的靶标基因有较好的沉默效果，这给我们筛选有效RNAi靶标基因提出了更高的要求。造成这种现象的原因有多种，其中dsRNA进入昆虫中肠或血淋巴中被降解是首要原因(Songetal., 2017; Guanetal., 2018)。其次，不同昆虫中Dicer对dsRNA的剪切形式不同也是导致RNAi效率差异的重要原因。因此，提高dsRNA在环境中和昆虫体内的稳定性，有助于提高对dsRNA不敏感昆虫的RNAi效率。目前这方面的研究主要集中在以脂质体或纳米粒子对dsRNA进行包裹避免被消化系统或环境中的各种酶降解(Jogaetal., 2016)。另外，RNAi过程中也可能存在脱靶问题，沉默非靶标基因，导致研究结果变的更加复杂(Kulkarnietal., 2006)，所以在细胞培养中观察到的基因沉默后的表型可能存在一定的偏差，还需要用真正的生物突变体，或用独立的dsRNA瞄准靶标基因的不同区域来进行验证。与RNAi相比较，CRISP/cas基因编辑技术极大的降低了靶标基因的脱靶效应，对未来昆虫抗病毒免疫研究有很好的推动作用。

即使在突变体的昆虫研究中得到了抗病毒的有力证据，还要考虑到昆虫品系遗传背景、外部环境和内部因素的影响，如在家蚕中，不同家蚕品系对病毒的抗性情况存在显著差异(陈克平等, 1991; 1996)。在进行昆虫体内抗病毒基因功能研究时，病毒感染途径也是影响昆虫抗病毒的重要因素。多数鳞翅目昆虫与病毒的互作研究中，是通过注射的方法直接将病毒注入生物体内，这种方法可以精准的控制病毒感染的时间和剂量。然而，在自然环境中，鳞翅目昆虫很少通过注射的方法获得病毒(Wilfertetal., 2016)，多数是通过直接取食获得病毒。病毒饲喂和注射法会引起昆虫不同的系统反应，进而影响昆虫的抗病毒研究(Ferreiraetal., 2014)。通过饲喂的方法口服病毒很难精准的控制病毒的感染时间和剂量，昆虫体内环境及发育阶段也会对昆虫抵抗病毒产生影响，如不同昆虫体内pH环境不同，鳞翅目昆虫只有在幼虫阶段可以接触到病毒，并且低龄期的幼虫抗病毒能力较差，而高龄期幼虫的抗病毒能力较强。

多数鳞翅目昆虫的抗病毒研究都是以细胞系为基础，其优点是可以在一个更为均一的细胞群中工作，更容易控制病毒感染的时间和剂量。但是以昆虫细胞系为载体进行抗病毒研究也存在一些不足，如：(1)某些昆虫的细胞起源不明，在长期单一条件下培养，细胞会被驯化，丧失天然昆虫细胞的一些特性，导致对病毒响应的不同；(2)昆虫细胞类型单一，缺乏不同组织细胞间的相互作用，不能真实反应昆虫体内的抗病毒情况；(3)某些昆虫细胞中可能存在潜伏病毒持续感染的现象，对抗病毒的研究结果产生干扰。上述因素会制约昆虫抗病毒免疫反应的研究(Marques and Imler, 2016)。

5 结语与展望

昆虫的抗病毒免疫途径表现出丰富的多样性，主要体现在RNAi、细胞的自噬与凋亡、Imd、Toll、JAK-STAT和STING等重要的免疫信号转导通路上。上述抗病毒反应在不同的昆虫中存在一定的保守性，但又拥其各自的独特性，各信号通路之间不是孤立反应的，而是相互响应的(Kingsolveretal., 2013)。目前，鳞翅目昆虫中免疫信号通路之间的相互关系尚不清楚，值得研究。除了在昆虫细胞中进行昆虫的抗病毒免疫研究外，应更多的利用RNAi和CRISP/cas技术在昆虫体内进行基因功能的研究。另外，病毒从昆虫肠道进入其循环系统以及病毒在昆虫体内的增殖中所面临的组织特异性的抗病毒途径也应该被关注。此外，昆虫肠道中的微生物群落对抗病毒免疫的影响也值得深入研究。

随着基因组测序技术的快速发展，目前已经获得了大量与鳞翅目昆虫免疫相关的基因(Jiangetal., 2013; Jiang, 2021)。尽管RNAi技术和转基因技术的广泛应用极大的促进了人们对昆虫先天免疫分子机制的了解(尹传林等, 2017)，但是对于已经鉴定到的多数鳞翅目昆虫免疫相关基因的功能及调控机制仍不清楚，且有关免疫相关基因的研究主要集中在模式昆虫家蚕上，对于其它一些重要的鳞翅目农业害虫的研究还比较匮乏。目前，利用病毒防控鳞翅目害虫是重要的生防手段，对这些害虫天然免疫系统的研究可为害虫防治新策略的开发提供新的突破口。

关于鳞翅目昆虫抗病毒免疫机制的研究，今后需重点关注以下三个方面的工作：(1)利用生物信息学方法继续挖掘免疫关键基因，利用RNAi、CRISPR/cas或转基因技术，深入挖掘这些基因的功能，明确其所属的免疫信号通路，阐明昆虫的抗病毒免疫反应的分子机制及各基因在抗病毒免疫中的调控作用。(2)加强病毒对昆虫的抗病毒免疫反应抑制作用的研究，揭示病毒的逃逸机制，为害虫防控新策略的研发提供新思路。(3)对某些重要害虫的基因组进行重测序和深度分析，进一步挖掘新的昆虫抗病毒途径和抗病毒基因。