胶质瘤患者血液CD26表达及其临床意义

张玉松 韩亚迪 冯 稳

CD26被称为二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-IV，DPP4)，是DPP4基因编码的一个具有酶活性跨膜蛋白[1]。基础与临床研究结果表明，CD26参与癌症的发生、发展过程中，如肺癌、胃癌[2，3]。CD26可以透过细胞膜分泌到膜外，成为可溶性CD26发挥作用。因此，CD26可作为一个新型的肿瘤标志物，参与肿瘤免疫治疗[4]。课题组前期研究显示，CD26水平在大鼠C6胶质瘤模型脑标本中表达增加，提示其在胶质瘤发生中扮演重要角色[5]。一些临床与基础实验表明，CD26与血糖平衡调节、酶的活性以及炎症通路密切相关[1]。本研究旨在探讨CD26在WHO不同病理分级胶质瘤患者血中的表达变化并分析其临床病理参数的关系，利用在线数据库探讨CD26参与疾病过程的蛋白质相互作用关系网络及信号转导通路。

材料与方法

1.标本来源:收集2016年1月～2019年12月来郑州大学附属肿瘤医院就诊的70例胶质瘤患者血液样本，其中WHOⅠ级9例(毛细胞型星形细胞瘤)，WHO Ⅱ级29例(弥漫性星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤)，WHO Ⅲ级24例(间变性星形细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤)，WHO Ⅳ级8例(胶质母细胞瘤)。所有患者病理均由两名神经病理学家根据2016版WHO中枢神经系统肿瘤分类进行组织学诊断，并从科室内网下载每个患者的临床信息。同时将2019年来医院体检的健康人20例作为对照组。本研究获得郑州大学附属肿瘤医院医学伦理学委员会批准并获得患者知情同意。

2.ELISA方法：ELISA方法检测血清中CD26变化水平。对采集的胶质瘤患者组和健康对照组血液样本行3000r/min，离心20min后取上清，-80℃冰箱保存备用。CD26 ELISA试剂盒购自美国R&D公司，严格按照操作说明书进行实验。酶标仪(美国PerkinElmer公司)上于450nm处读取数值。依据标准品的浓度及对应的A值绘制标准曲线，计算样品中蛋白浓度，并取平均值。

3.荧光实时定量PCR检测(qRT-PCR)检测血液中CD26 基因水平:提取胶质瘤患者组和对照组全血样本的总RNA，利用PCR反转录试剂盒(天根生化，北京)立即将RNA反转录(冰上进行)成 cDNA 作为模板，加样后混匀离心。根据每个基因的cDNA序列设计特异的荧光定量PCR引物检测各个基因的表达情况；严格按照天根生化荧光定量试剂盒标准操作方法操作。反应条件：预变性 94℃ 1min，94℃变性 30s，退火15s，68℃延伸15s，40个循环。本研究涉及CD26引物均使用Primer Premier 5设计，由上海生工公司合成，选取 β-actin 基因为内参基因。数据由美国伯乐 IQ5 荧光实时定量PCR仪产生和分析。反应产物经融解曲线鉴定为单一产物，PCR数据使用2-ΔΔcT法计算和统计。引物序列详见表1。

表1 CD26的引物序列

4.蛋白质相互作用网络构建:选择蛋白-蛋白相互作用网络构建数据库String(http：∥string?db.org/cgi/input.pl)，对CD26蛋白质相互作用间信息进行分析并构建分子PPI网络。利用GO和KEGG数据库研究CD26参与的蛋白质相互作用功能网络及信号转导通路。

5.免疫组化:兔单抗ATRX抗体(1∶500稀释，ab97508)购自美国Abcam公司，Evision两步法染色。判读标准：每张切片随意选取5个高倍镜，计算核阳性细胞的百分比，阳性细胞数目>10%为阳性，ATRX表达；≤10%为阴性，ATRX失表达。

6.IDH1/2测序分析：收集70例胶质瘤患者标本送到上海生工公司进行测序来检测IDH1/2突变与否，根据文献[5]进行操作。

结 果

1.70例胶质瘤患者临床资料分析:收集70例胶质瘤患者，其中WHOⅠ级9例(毛细胞型星形细胞瘤)，WHOⅡ级29例(弥漫性星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤)，WHO Ⅲ级24例(间变性星形细胞瘤和间变性少突胶质细胞瘤)，WHO Ⅳ级8例(胶质母细胞瘤)。男性患者39例，女性患者31例，患者年龄3～82岁，平均年龄43.09±4.57岁。其他临床信息可从医院内网获的。健康对照组20例，男性10例，女性10例，平均年龄45.90±4.28岁，既往无神经系统疾病或肿瘤史。胶质瘤患者与对照组在年龄与性别上差异无统计学意义(P>0.05)。

2.不同病理级别胶质瘤患者血清CD26水平变化情况：胶质瘤患者血清CD26水平(Ⅰ级：496.10±16.67pg/ml，Ⅱ级：553.10±12.81pg/ml，Ⅲ级：625.90±14.78pg/ml,Ⅳ级：846.10±20.91pg/ml)显著高于健康对照组(408.30±10.31pg/ml,P=0.000)，其中，Ⅱ级与Ⅰ级、Ⅲ级与Ⅱ级、Ⅳ级与Ⅲ级比较，P均<0.05。

3.胶质瘤患者血清CD26水平与胶质瘤病理级别的关系：胶质瘤患者血清中CD26水平显著高于对照组(P=0.000)。随着胶质瘤WHO病理分级的增高，血清CD26水平也随之增加，差异有统计学意义(P<0.05，P=0.000)。血清CD26水平变化与胶质瘤病理分级具有相关性。

4.胶质瘤患者血清CD26水平与临床病理特征的关系：胶质瘤患者血清CD26水平与IDH1/2的状态密切相关(P<0.05)，与年龄、性别、原发肿瘤直径、部位、远处转移、ATRX状态、放化疗以及癫痫发生病史无关(P>0.05)，详见表2。

表2 胶质瘤患者血清CD26水平与临床病理特征的关系

5.胶质瘤患者血液中CD26 mRNA水平变化:qRT-PCR结果显示，与对照组比较，不同病理级别胶质瘤组患者CD26 mRNA水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。此外，随着胶质瘤病理级别的增加，CD26 mRNA水平也显著增加(P<0.01)，详见图1。

图1 qRT-PCR结果显示不同病理级别胶质瘤组患者血CD26 mRNA水平增加*P<0.01，**P=0.000

6.CD26与其他蛋白质之间PPI分析:采用String (http:∥string-db.org/)蛋白质相互作用数据库中的蛋白质信息进行分析,PPI分子网络表明， CD26 与 INS、GIP、SLC5A2、SLC5A4、GCG、GLP1R、ADA、MME、ACE2、PRCP这10个蛋白的相互作用较多, 详见图2。

图2 利用在线数据库研究与CD26(DPP4)相关的PPI分子网络图

7.CD26的GO功能注释和KEGG通路分析：采用GO和KEGG富集通路数据库分析CD26参与的信号网络。结果表明，CD26与机体生物学功能和细胞内外信号转导通路密切相关，详见表3。

表3 CD26的GO和KEGG通路富集分析

讨 论

胶质瘤又称神经胶质瘤，是一种神经系统常见的肿瘤，具体表现为侵袭性生长，对人类身体健康危害程度较大，临床主要手术切除并辅以放化疗治疗。CD26(DPP4)是一种具有酶活性的跨膜细胞表面蛋白，与T淋巴细胞的活化有关。最近，人们发现了CD26的可溶形式，其缺少细胞质区域和跨膜区域；CD26除了能够降解肠促胰岛素，还能够调节多种趋化因子和神经肽Y(nerve peptide Y，NPY)。在肝细胞性肝癌中，抑制CD26酶活性可以增强自然杀伤细胞趋化因子细胞生物轴活性，改善肿瘤免疫功能[6]。CD26抑制剂也可以抑制肿瘤血管生成，激活淋巴细胞趋化因子生物轴降低小鼠肝细胞癌[7]。研究显示，外周血中CD26通过Caveolin-1蛋白共同刺激淋巴细胞分化在糖尿病发生、血压调节及肾脏疾病发生中扮演重要角色[8]。此外，CD26在甲状腺乳头状癌高水平表达，是其较有希望的肿瘤标志物[9]。本研究结果表明，与对照组比较，血清CD26水平在胶质瘤患者中显著增加，与上述结果保持一致[8,9]。此外，分析CD26水平与患者的临床病理参数关系发现，血清CD26水平与IDH1/2的状态密切相关，与年龄、性别、原发肿瘤直径、部位、远处转移、ATRX状态、放化疗以及癫痫发生病史无关。文献报道，IDH1/2突变的胶质瘤有较好的预后。研究结果显示，与IDH1/2突变型比较，CD26水平在IDH1/2野生型胶质瘤中显著增加，提示IDH1/2突变型胶质瘤患者有较低的CD26水平。

研究显示，抑制CD26酶可以通过CXCL12(C-X-C motif chemokine ligand 12)/CXCR4(C-X-C receptor 4)/mTOR生物轴促进上皮-间充质转化，进而影响乳腺癌代谢[10]。在乳腺癌中CD26的表达与TGF-β(transforming growth factor-β)和SDF-1(stromalcell-derived factor-1)信号转导通路相关，敲低TGF-β和SDF-1可以增加CD26的表达水平并与乳腺癌的预后密切相关[11]。CD26的表达在胃癌发生中起重要作用，它是胃癌侵袭能力、远处转移、临床病理分期以及早期预警的指标[12]。在结肠癌中，CD26水平与性别及DPP4酶活性密切相关[13]。生物信息学方法可以提供基因水平表达以及参与的信号讨论，预测疾病潜在的治疗靶点。本研究通过在线数据库进一步分析CD26参与生命过程的信号通路及密切相关的基因功能网络。数据表明，CD26参与酶活性、蛋白的分泌和消化、糖的代谢、免疫系统的功能调节等生命过程中，进而参与疾病发生。胶质瘤是成人常见的中枢神经系统肿瘤，笔者课题组前期报道CD26蛋白和mRNA水平在胶质瘤大鼠模型标本中表达显著增加。此外，CD26可以依赖其酶活性抑制胶质瘤细胞系的生长[14]。以上研究表明，CD26可以作为新型的潜在肿瘤标志物[4,5,15]。

本研究中胶质瘤患者血标本中CD26蛋白和mRNA表达增加，这与之前的数据结果相一致[5]。CD26酶抑制胶质瘤细胞系生长，说明CD26可能在胶质瘤发生、发展中扮演重要角色。近来研究表明，CXCL12/CXCR4信号转导通路在胶质瘤侵袭和发展中起作用[16,17]。笔者推测CD26可以通过调控CXCL12/CXCR4信号转导通路进而影响胶质瘤发展过程。