自养殖池塘中分离出的一株枯草芽孢杆菌对养殖水质的影响

李海洁，董小林，郭国军，杨雪冰，林雅云，曹亚奇，李国喜，刘变枝

（1.河南农业大学动物科技学院，河南 郑州 450002；2.广东海大集团股份有限公司，广东 广州 511400；3.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；4.河南省水产技术推广站，河南 郑州 450008）

水质是影响水产养殖动物生长和发育的重要因子。近年来，随着我国高密度集约化水产养殖业的快速发展，水体中残饵、粪便等内源性有机污染日趋严重，养殖水体中氨态氮（NH4+-N）、亚硝态氮（NO2--N）、化学需氧量（COD）等有毒有害物质含量急剧增加，严重超标，成了制约水产养殖环境的主要因子[1,2]。水体中的非离子氨是氨氮对养殖生物的主要危害形式，其浓度直接反映水体氨氮的毒性。亚硝酸盐是养殖水体中另一种常见的含氮毒性污染物，被视为养殖水域中诱发鱼类爆发性疾病的重要因素和致病的根源[3]。COD 是反映水体中有机及无机氧化物污染的常用指标，COD 含量高说明水体还原性物质过高，水体受污染程度大，严重时造成鱼类死亡[4,5]。养殖水体中有机氮（残饵、代谢物）的不断累积是水体中氮超标的根本原因，亚硝酸盐浓度和水体COD 含量与养殖过程中的残饵、粪便以及肥料、浮游植物丰度等关系密切。因此，寻找安全、快速便捷的养殖水体水质净化处理技术，有效解决高密度养殖水体中水质问题将是水产养殖业健康、可持续发展的必然举措，是目前水产从业人员亟待解决的问题。

在众多养殖水体净化技术中，微生态制剂以经济、环保、安全、无抗药性等成为养殖水域生态环境治理的热门研究领域。芽孢杆菌Bacillus 分布广、增殖快、抗逆性强，能分泌多种高活性的消化酶和抑菌物质,是现代微生物研究的热门对象。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）是芽孢杆菌属中研究和应用较为广泛的一种，是我国农业部正式批准使用的益生菌，具有耐高温、耐酸、耐盐、抗逆性强等特点，可作为添加剂提高饲料利用效率、促进机体健康，还具有消耗水体中有机物、抑制致病菌繁殖、净化养殖水体的作用[6-8]，是水质调控中常用的微生物种类。目前，有关枯草芽孢杆菌净水效果的研究较多，但由于评价方法和试验周期不一致、试验方法不严谨等问题，研究结果可比性差，部分研究菌株并非来自水产养殖业，评价中未能充分考虑水体自净作用等，尽管目前市场上枯草芽孢杆菌产品较多，但市场现有枯草芽孢杆菌使用效果参差不齐，效果不稳定。与物化法相比，生物脱氮法虽具有环保、安全等特点，但其净水效果受菌株投放数量、菌株定植特性与定植能力、水体微生物种类与数量、水体营养物质、水体理化指标（如溶氧、温度等）等多方面的影响。养殖中天气、温度、溶氧等环境因子改变均可导致上述因素改变，影响菌株的净水能力。因此，筛选来源于养殖水体、降解效率高、起效快的有效发挥净水作用的枯草芽孢杆菌菌株，对快速改善水质，避免或缓解鱼类急性中毒，保障水产养殖安全具有重要意义。

本试验评价广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心从养殖池塘中分离出的一株枯草芽孢杆菌在短时间对常规罗非鱼养殖池塘水体的净化效果，以期筛选快速、高效降解水体有害物质的枯草芽孢杆菌菌株，为本土化微生物净水产品的开发和应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验用枯草芽孢杆菌由广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心动保技术研究所从广东海大集团海鸥岛基地养殖池塘中分离提供。正式试验前，用液体培养基培养48 h，制备浓度约109cfu/mL 的应用菌液，冷藏备用。

试验用水取自广东海大集团股份有限公司研究中心海鸥岛研究基地的常规罗非鱼暂养塘。试验开始前，连续检测池塘水质指标，至池水氨态氮（NH4+-N）含量为0.5007 mg/L，亚硝态氮（NO2--N）含量为0.0558 mg/L，化学需氧量（COD）6.9009 mg/L 时开展试验。

试验前，将池水抽入24 个有效水体积250 L 循环水养殖缸内，循环12 h，然后取水样检测，确保各养殖缸内水质指标完全一致后，停止水体循环，改为静水，微曝气，开始试验。整个试验过程中，试验缸内不放置底泥、鱼类等生物，不投饵。

1.2 方法

试验共设8 个处理组，分别量取0.25 mL（BS1）、1.25 mL（BS2）、2.5 mL（BS3）、12.5 mL（BS4）、25 mL（BS5）、62.5 mL（BS6）和125 mL（BS7）的应用菌液，水体菌液终浓度分别为1×103cfu/mL、5×103cfu/mL、1×104cfu/mL、5×104cfu/mL、1×105cfu/mL、2.5×105cfu/mL 和5×105cfu/mL，每组3 个平行，以无添加组为空白对照（C 组）。试验进行5 d。

试验期间，水温保持在（29.2±0.6）℃，自然光照，微管曝气。试验开始后第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d 的早上7：00，利用虹吸法在水面下方30 cm 处采集水样，测定氨态氮（NH4+-N）含量、亚硝态氮（NO2--N）含量和化学需氧量（COD）。所取水样保存在4℃冰箱待测，当天测定完毕。

NH4+-N含量按照HJ 535-2009 标准采取纳氏试剂分光光度法测定；NO2--N 含量按照GB 7493-87 标准采用N-（1-萘基）-己二胺分光光度法测定；COD 含量按照按GB 11892-89 标准采用酸式高锰酸钾指数法测定。

1.3 数据分析

数据以“平均值±标准误”表示，用SPSS（20.0）软件进行分析处理。数据经齐性检验（Homogeneity of variances）后，采用one-way ANOVA 方法做一元方差分析。若数据差异显著，则进行Duncan’s 多重比较（Duncan’s multiple range test），P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体NH4+-N含量的影响

由表1 可知，各组水体中NH4+-N含量均随时间延长而显著上升至最高后下降（P＜0.05），实验结束时添加浓度≥1×105cfu/mL 组仍显著高于初始水平（P＜0.05）。同一时间，添加剂量≥2.5×105cfu/mL时1 d 内显著降低水体NH4+-N含量（P＜0.05），随后水体NH4+-N含量明显反弹，前期降幅越大，后期反弹幅度越大（P＜0.05）。在同一取样时间，对照组NH4+-N含量为基准计算得到的去除率，表明高剂量添加下短期内可有效去除水体NH4+-N，后期出现反弹（图1）。

表1 不同浓度BS 对水体NH4+-N 含量的影响（平均值±标准误，n=3）Tab.1 Effect of different concentrations of BS on ammonia-nitrogen content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

图1 各取样时间点以对照组为基准的NH4+-N去除率Fig.1 Removal rate of NH4+-N at each sampling time compared with the control group

2.2 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体NO2--N含量的影响

由表2 可知，尽管各组水体NO2--N 含量均随试验时间延长显著升高（P＜0.05），以同一取样时间对照组水体NO2--N 含量为基准计算的去除率数据表明，该菌株添加浓度＞1×105cfu/mL 时具有明显的剂量依赖降NO2--N 的作用（P＜0.05）。添加剂量5×105cfu/mL 对水体NO2--N 去除率可高出水体自净能力的75%（图2）。

表2 不同浓度BS 对水体NO2ˉ-N含量的影响（平均值±标准误，n=3）Tab.2 Effect of different concentrations of BS on nitrite content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

图2 各取样时间点以对照组为基准的试验组NO2--N去除率Fig.2 Removal rate of NO2--N at each sampling time compared with the control group

2.3 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体COD 含量的影响

由表3 可知，对照组、添加剂量≤5×104cfu/mL组水体COD 含量于第2 d 即显著降至最低（P＜0.05）。添加剂量≥1×105处理组水体COD 含量则在第2 d 显著升至最高后又恢复至初始水平。同一取样时间点添加剂量≤5×104cfu/mL 组水体中COD 含量无显著差异（P＞0.05），添加剂量≥1×105cfu/mL 组水体COD 含量呈明显剂量递增（P＜0.05）。以同一取样时间对照组水体COD 含量为基准计算的去除率数据表明：该枯草芽孢杆菌各添加浓度对水体COD 无明显去除作用（图3）。

表3 不同浓度BS 对水体COD 含量的处理（平均值±标准误，n=3）Tab.3 Effect of different concentrations of BS on COD content in the water（Mean ± SE,n=3）/mg·L-1

图3 各取样时间点以对照组为基准的试验组COD 去除率Fig.3 Removal rate of COD at each sampling time compared with the control group

3 讨论

3.1 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体NH4+-N含量的影响

本试验中，各组水体中NH4+-N含量均出现短期升高的现象，推测是水体有机质有氧氧化分解所致[9,10]。同一取样时间点以对照组NH4+-N含量为基准计算的去除率数据表明：添加剂量（≥2.5×105cfu/mL）时该菌株具有短期剂量依赖效应去除水体NH4+-N含量的作用，随后出现剂量依赖性反弹，推测是添加浓度≥2.5×105cfu/mL 时引起水体生物间竞争性死亡、水体中增加的还原性物质向NH4+-N转化所致。本试验中，高浓度添加组（≥2.5×105cfu/mL）水体COD 含量于试验第2 d 显著升高后下降，水体NH4+-N含量于第3 d 显著上升也一定程度上说明该菌添加初期导致水体还原性物质增多，增多的还原性物质向NH4+-N转化，添加枯草芽孢杆菌后水体氨氮先下降后上升的现象，在其他研究中也有报道[11]。枯草芽孢杆菌是具有高活性消化酶的需氧异养菌，无淤泥、无投饵等外源性有机质输入下高剂量添加势必会引起水体微生物群落间的竞争性改变和水体还原性物质增多[11]。张念海[12]研究发现，芽孢杆菌的添加可竞争性地抑制水体中某些优势藻类的生长。王月霞等[13]也发现，鱼塘水体中色球藻Chroococcus 数量与芽孢杆菌添加量呈典型负相关。本试验目的是为了检测该菌株的短期水质净化能力，故未对长时间下水体微生物间的相互作用及其动态变化趋势进行研究。

3.2 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体NO2ˉ-N含量的影响

水体中NO2--N 能将鱼类血红蛋白中的二价铁氧化为三价铁，损害血液的运氧能力，引起鱼类窒息死亡[14,15]。有效控制水体中NO2--N 含量是决定养殖成败的重要因素。本试验中，各组水体NO2--N呈上升趋势，NH4+-N在升至最高后下降，说明该菌株添加初期水体氨氧化引起的亚硝化占主导作用[16]。同一时间下，高剂量添加组（＞1×105cfu/mL）水体中NO2--N 含量呈现明显剂量递减效应，添加浓度＞1×105cfu/mL 时该菌株对水体NO2--N 的清除效率比对照组高75%，表明一定剂量下该菌株具有明显的降低NO2--N的作用。

枯草芽孢杆菌对水体NO2--N 的去除效果受菌株投放数量、菌株定植特性和能力、水体微生物种类与数量、水体营养物质含量、溶氧、温度等多因素的影响。朱长生等[5]研究发现，泼洒复合芽孢杆菌菌剂（水体终浓度为1.5×104cfu/mL）后，短期（1 d）可有效降低水体NO2ˉ-N，7 d 后效果丧失；邹文娟等[17]在水体中投放终浓度为0.25×105cfu/mL 的枯草芽孢杆菌后，水体中NO2--N含量前期显著上升，7 d后下降；温志新等[18]在刺参Apostichopus japoncus养殖水体中发现，未充气状态下，枯草芽孢杆菌对养殖废水中的氨氮和亚硝酸盐无有效去除作用；王月霞等[13]发现，池塘水体溶氧量上升至6 mg/mL时，所用枯草芽孢杆菌才有明显去除水体NO2--N的效应；汤宝贵等[19]在对虾养殖池的净化研究中发现，添加1.04×105～2.08×105cfu/mL 芽孢杆菌，短时间（≤24 h）内可显著降低水体NO2--N的含量，但随着时间延长剂量相关效应消失。也有研究发现，简单水体中添加过量枯草芽孢杆菌会导致水体负荷增大，影响水体生态平衡，不利于发挥净水作用[12]，水体氧气不足或水体添加浓度过高，均会导致菌种密度、水体空间和营养物质的制约效应，抑制其对水体氨氮和NO2--N的去除作用。本实验中，该菌株添加量为5×105cfu/mL 时，降NO2--N效果显著高于汤宝贵等[19]、温志新等[18]研究中所用菌株，与朱长生等[5]所用复合芽孢杆菌菌剂效果相当。总体而言，本试验所用菌株可作为快速有效降低水体NO2--N含量的目标菌株，但尚需与其他有效降低水体NH4+-N 和COD 的产品进行配伍，以更好地发挥净水作用。

3.3 不同浓度枯草芽孢杆菌对水体COD 含量的影响

本试验中，试验期间对照组水体COD 含量持续降低，说明水体具有一定的自净作用，是水体自养型生物同化和异养型生物分解作用的共同体现[20 ]。

同一取样时间添加浓度≤5×104cfu/mL 组水体COD 含量与对照组无显著差异，说明低浓度该菌株（≤5×104cfu/mL）下水体自净作用占主导因素；高剂量（≥1×105cfu/mL）添加时，试验第2 d 水体COD 含量明显呈剂量依赖上升效应，是高浓度添加导致水体还原性物质短期快速增多所致。从时间上看，添加剂量≥1×105cfu/mL 组水体中COD 先迅速上升至最高又迅速下降至初始水平，说明该菌株具有一定的COD 清除能力。试验结束时，BS6 和BS7 组水体COD 含量仍高于同一时间点对照组水体COD 含量，推测应是试验周期短所致。添加一定浓度枯草芽孢杆菌时，水体COD 含量先升后降与刘树彬等[21]评价枯草芽孢杆菌HAINUP40 对养殖废水中COD 的去除趋势一致。

3.4 结论

本试验所用枯草芽孢杆菌菌株添加量为2.5×105～5×105cfu/mL 时，可在短期内有效降低养殖水体中NO2－-N 含量，对去除水体NH4+-N含量和COD 也有一定效果，故该菌株可作为有效去除水体NO2－-N的目标菌株，但因枯草芽孢杆菌是严格的需氧型异养菌，添加的芽孢杆菌直接参与到水体微生物群落间的相互竞争中，短期内易造成水体中还原性物质增多，故使用该菌株应与其他能有效去除水体NH4+-N和COD 的菌株配合使用。