基于GC－MS代谢组学的大鼠肝脏代谢谱时序性变化的性别差异研究

2021-10-17戴鑫华常艳波范玮豪廖林川

分析测试学报 2021年9期

戴鑫华，向瑾，常艳波，范玮豪，杨虹，杨林，叶懿，廖林川*

（1.四川大学华西基础医学与法医学院，四川成都 610041；2.四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041）

死亡时间（Postmortem interval，PMI）即发现和检验尸体时距死亡发生时的时间间隔［1］。PMI推断历来是法医学研究的热点问题。传统的PMI推断方法主要依据死后尸体现象、超生反应、胃内容物的消化程度、尸体腐败程度等综合判断，但具有一定的主观性和经验性，方法灵敏度较低，整体准确性不高［2－3］。准确可靠的PMI推断仍是法医学研究和实践工作中的一大挑战。

尸体的分解是一个复杂的化学反应。机体死后由于组织细胞缺少氧气，以及超生反应、合成代谢的终止和细胞的自溶及微生物的分解过程，致使全身多组织中代谢物广泛变化，由脂类、蛋白质和核酸等大分子物质逐渐降解为氨基酸、脂肪酸和核苷酸等小分子代谢物［4］。代谢组学（Metabolomics/metabonomics）是以生物样品中分子量＜1000Da的小分子代谢物为研究对象，结合高通量的检测技术，探索生物体内代谢物的变化情况［5］。代谢组学技术可同时检测生物体死后不同时期的多种小分子代谢物，有助于了解多种代谢物在死后的变化情况，为PMI推断提供有效信息。近年来，代谢组学技术已逐渐被国内外学者应用于PMI推断研究［6–9］。

虽然现有的基于代谢组学的PMI推断研究取得了一定进展，但总体来说仍处于探索阶段，各种内外界影响因素是否会对死后代谢物变化产生影响，尚不明确。性别是影响尸体腐败和PMI推断的内源性因素之一，已有研究表明，女性尸体由于皮下脂肪组织更厚，其腐败速度较男性更快［10］。同时，生物体内部分代谢物水平已被证实存在性别差异［11－12］，但性别对死后肝脏中代谢物变化的影响尚未见研究报道。本研究利用气相色谱－质谱联用（Gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS）代谢组学技术，分析不同性别大鼠窒息死后不同时间肝脏样本的代谢谱，旨在探索性别差异对肝脏组织代谢物死后变化规律的影响。

1 实验部分

1.1 实验动物

SPF级（无特定病原体，Specific Pathogen Free）SD大鼠72只，雌雄各半，体重（200±20）g，购自成都达硕实验动物有限公司。实验前适应性饲养5d，自由饮水进食。所有实验均按照四川省实验动物管理委员会的规定进行，符合《实验动物饲养管理和使用指南》。

1.2 仪器与试剂

甲氧胺盐酸盐（纯度99%）、2-氯-苯丙氨酸（纯度98%）均购自北京百灵威科技有限公司，N，O-双（三甲基硅）三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（BSTFA+1%TMCS）（纯度≥98%）购自北京Solarbio科技有限公司，乙腈（色谱纯）购自美国Fisher Chemical公司，乙醚、乙酸乙酯、丙酮和吡啶（分析纯）均购自成都市科隆化学品有限公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 肟化试剂精密称取甲氧胺盐酸盐0.20200 g于10mL容量瓶中，加入吡啶溶解并定容至刻度，配成20mg/mL的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液，于4℃冰箱中保存备用。

1.3.2 内标溶液精密称取2-氯-苯丙氨酸0.02550 g于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，配成2.5 mg/mL2-氯-苯丙氨酸甲醇溶液（母液），于4℃冰箱中保存。使用前将母液用甲醇稀释成250µg/mL的工作液。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物模型建立及分组36只雌性大鼠和36只雄性大鼠经乙醚麻醉后，建立大鼠机械性窒息死亡模型。将雄性大鼠和雌性大鼠均随机分为死后0、6、12、24、48、72h共6组，每组6只。

1.4.2 样本采集大鼠于死后立即称重并以仰卧位置于温度（25±1）℃、湿度（50±1）%的恒温恒湿箱中，于死后不同时间点分别取出大鼠尸体，解剖后分别采集每只大鼠的肝脏右叶，立即放入液氮中冷冻保存，待检。

1.4.3 样本前处理称取肝脏组织样本约75mg于2mL离心管中，加入3倍重量的生理盐水，冷冻研磨1min，获取肝脏组织样本匀浆液。取匀浆液100µL，加入250µg/mL的2-氯-苯丙氨酸甲醇溶液20µL，涡旋混匀后加入冰乙腈300µL，再涡旋1min后于冷冻离心机中4℃下以12000r/min离心5min，取100µL上清液，氮气流下挥干。残渣加入20mg/mL肟化试剂30µL，置于80℃烘箱中肟化15min；再加入BSTFA+1% TMCS（硅烷化试剂）30µL，置于80℃烘箱中硅烷化15min；上清液进GC－MS分析。

取所有肝脏样本的乙腈处理液各30µL，混合后制成质量控制（Quality control，QC）样本。QC样本的处理与肝脏组织样本相同。

1.4.4 GC－MS实验条件色谱条件：色谱柱采用DB－5MS毛细管色谱柱（30m×0.25 mm，0.25 µm），载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min，分流比5∶1，进样口温度250℃，辅助加热器温度230℃；采用梯度升温，起始温度60℃，保持1min，以8℃/min升至300℃，保持7min。

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质谱条件：离子源温度230℃，四极杆温度150℃，溶剂延迟4.5 min，采用电子轰击电离方式（EI），电离能量为70eV，采用全扫描模式监测，全扫描范围50～600amu。

所有待测样本均以随机顺序进行检测分析，每8针实验样本之间进1针QC样本，重复循环，直至检测完全部样本。

1.4.5 数据分析采用XCMS（https：//xcmsonline.scripps.edu）进行离子碎片提取、保留时间校准、色谱峰对齐等处理。利用NIST2014质谱库（Agilent公司，美国）对色谱峰进行定性分析，筛选出匹配度≥80%的代谢物。将每种代谢物的峰强度除以各自样本的内标（2-氯-苯丙氨酸）峰强度，计算得所有代谢物的相对峰强度。

采用主成分分析（Principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）分别对雌性和雄性大鼠不同PMI的肝脏样本进行分析，筛选PMI相关差异代谢物。差异代谢物筛选标准为变量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）＞1.0 且Kruskal－Wallis（K－W）检验值p＜0.05。挑选出不同性别中均与PMI相关的共同差异代谢物，分析大鼠死后共同差异代谢物的变化趋势，并利用Studentt检验比较每种代谢物在不同性别间的差异。

2 结果与讨论

2.1 代谢组学方法稳定性评估

每种组织中的QC样本是所有该组织样本的混合，将QC样本穿插在所有实验样本的检测中，以此评估和验证GC－MS检测平台的稳定性［13－14］。雌雄大鼠肝脏组织QC样本的PCA得分图见图1。由图可知，雌雄大鼠的肝脏QC样本均较为聚集，表明样本在检测时系统误差较小，GC－MS检测平台稳定性好。

图1 雌雄大鼠肝脏QC样本的PCA得分图Fig.1 PCA score plots of liver samples of QC samples of male（A）and female（B）rats

2.2 主成分分析

雄性和雌性大鼠死后不同时间肝脏样本的PCA得分图见图2。如图所示，雄性大鼠和雌性大鼠各组内样本均分布集中，说明各组样本组内差异均较小；雄性大鼠和雌性大鼠各组间样本分离较好，基本无重叠，且均随PMI升高呈现由左向右的位移趋势，说明各PMI组间差异均较为显著，且死后肝脏代谢谱信息可能与PMI呈规律性变化。

图2 雌雄大鼠肝脏样本的PCA得分图Fig.2 PCA score plots of liver samples of male（A）and female（B）rats

2.3 偏最小二乘法分析

雄性和雌性大鼠死后不同时间肝脏样本的PLS得分图见图3。如图所示，在PLS模型中，雄性大鼠和雌性大鼠各组间样本均能有效区分。

图3 雌雄大鼠肝脏样本的PLS得分图Fig.3 PLS score plots of liver samples of male（A）and female（B）rats

采用交叉验证和置换验证对PLS模型的有效性和可靠性进行验证。雌雄大鼠肝脏样本PLS模型的7折交叉验证和200次置换验证结果见图4和表1。在交叉验证中，R2和Q2均大于0.5 ，且R2与Q2的差值大于0、小于0.3 ，表明模型拟合较好［15］。在置换验证中，R2在Y轴上的截距小于0.4 且Q2在Y轴上的截距小于0.05 ，表明模型拟合较好，未发生过拟合［16］。由表1数据可知，雄性大鼠和雌性大鼠肝脏样本PLS模型的交叉验证中R2和Q2均较高，且差值均接近于0；在置换验证中，R2Y均小于0.4 ，Q2Y均小于0.05 。表明雌雄大鼠肝脏样本的PLS模型均有效可靠，拟合较好，未出现过拟合。

图4 雌雄大鼠肝脏样本PLS模型的置换验证图Fig.4 Permutation results of PLS models of liver samples in male（A）and female（B）rats

2.4 雌雄大鼠死后肝脏的差异代谢物分析

雄性大鼠肝脏中共筛选出42种与PMI相关的差异代谢物，雌性大鼠肝脏中共筛选出41种与PMI相关的差异代谢物，雌雄大鼠肝脏中与PMI相关的共同差异代谢物31种（59.6%），包括氨基酸、脂肪酸、生物胺等生物体内的内源性代谢物或死后分解代谢产物（图5）。共同差异代谢物的基本信息、VIP值和p值见表2。

表2 雌雄大鼠肝脏共同差异代谢物汇总表Table2 Summary of common differential metabolites of liver in male and female rats

图5 雌雄大鼠肝脏样本中共同差异代谢物的韦恩图Fig.5 Venn diagram of common differential metabo⁃lites of liver samples between male and female rats

肝脏、肾脏、脑、心脏和肌肉组织中多种氨基酸水平与PMI的相关性已被证实，氨基酸浓度随PMI延长而逐渐增加［4］。本研究在肝脏组织中也筛选出多种与PMI相关的氨基酸，与上述研究结果一致，表明氨基酸水平在死后的变化有望为PMI推断提供有效信息。脂肪酸是甘油三酯的分解代谢产物，已有研究发现某些脂肪酸的浓度变化与PMI存在相关性。Sato等［8］、蔡山青等［17］通过代谢组学技术在大鼠血液、脾脏中筛选出月桂酸、油酸和亚油酸等长链脂肪酸，可作为PMI特征代谢物；Dai等［18］在敌敌畏中毒死亡大鼠血液中发现油酸、亚油酸、硬脂酸和软脂酸的死后浓度变化与PMI呈相关性。本研究在大鼠肝脏组织中同样发现部分长链脂肪酸与PMI相关性较强，如花生四烯酸、二十碳二烯酸、二十二碳六烯酸和油酸等。生物胺类物质是蛋白质和氨基酸的分解产物，与死后腐败作用相关，但其在PMI推断中的作用存在一定争议。Vass等［4］在不同组织中检出多种生物胺类物质，但发现其与PMI之间相关性不高。然而，最近也有研究发现，脑组织中的尸胺、腐胺、乙醇胺等生物胺水平与PMI相关性强，可用于PMI推断［19－20］。本研究在肝脏组织中检出尸胺、腐胺、乙醇胺、酪胺和组胺等多种生物胺，发现其与PMI相关性较强，能为PMI推断提供帮助。

Number of princi⁃pal components Q2 Q2Y Group Male Female 22 Cross validation R2 0.989 0.98 9 0.985 0.98 2 Permutation test R2Y 0.235 0.24 5－0.194－0.18 5

2.5 肝脏中死后代谢物的性别差异

对不同性别大鼠肝脏中31种共同差异代谢物在每个时间点的相对浓度进行Studentt检验，比较结果见图6。由图可知，共有18种代谢物在死后不同时间点存在性别差异。这些性别间存在差异的物质可分为2类。第一类是死亡即刻（0h）及后续时间点均存在性别差异的代谢物，包括酪醇、L-谷氨酸、花生四烯酸、二十碳二烯酸、甘油酸、磷酸甘油、4-羟基丁酸和α-酮戊二酸。这些物质可能在死亡前即存在性别差异，其可能原因为性染色体的差异和特定基因表达的差异，也与周期性、差异性的性激素相关［21］。同时，外界环境的刺激（如饮食和运动等）也会进一步扩大性别间的差异［22］。Ruoppolo等［23］研究发现肝脏和肾脏中大部分氨基酸含量并未表现出性别差异。本研究同样发现，在大鼠的肝脏中存在性别差异的氨基酸较少。需要特别注意的是，肝脏组织中花生四烯酸在0h和6h时存在性别差异，而在6h之后无显著性差异。这可能是由于肝脏中磷脂的总量在不同性别间的差异不大，但性别的差异可能致使从肝脏磷脂中游离出的花生四烯酸的含量不同，死后随着肝脏中磷脂分解代谢的逐步进行，花生四烯酸在性别间的差异逐渐缩小。第二类是死亡早期性别差异不显著、死亡24h之后表现出性别差异的代谢物，包括L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、N-乙酰-赖氨酸、尸胺和腐胺，均为氨基酸和生物胺。这些物质均在死后48h和72h出现性别差异，这可能是由于各组织器官中死后微生物群落数量和种类的性别差异，影响了微生物的分解作用，从而引起组织中多种代谢物浓度的差异［24－25］。