自动QuEChERS结合气相色谱－串联质谱法测定花生中297种农药残留

蒋康丽，扈 斌，吴兴强，谢瑜杰，李铁梅，范春林，王明林，王雯雯，陈 辉*

（1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；3.安捷伦科技（中国）有限公司，北京 100102）

花生是我国重要的油料作物和经济作物，花生出口已成为我国经济发展以及对外贸易的重要产业［1］。然而由于花生病虫害、环境污染、种植方式改变等因素，花生的农药使用量越来越大，农药残留超标严重影响花生品质及食用安全，限制了我国花生出口贸易的发展，给我国经济带来不利影响［2］。但花生基质成分复杂，脂肪含量高，同时含有蛋白质、脂肪酸和糖类等成分，如何有效去除基质干扰，成为花生等油料作物农残检测工作中亟需解决的问题［3－4］。

自动QuEChERS前处理设备是一款由自动程序控制分析样品制备的设备，通过配套试管的联合使用（外管提取，内管净化），将样品提取与净化整合一体完成，极大提高了样品的前处理效率［5］。王济世等［6］利用自动QuEChERS法检测玉米中的133种农药残留，回收率在70%～120%之间；陈婷等［7］利用自动QuEChERS法检测大米和马铃薯中的34种农药残留，回收率为53.0 %～125%，而利用自动QuEChERS检测花生中农药多残留的分析少见报道。

由于农药大多具有挥发性和疏水性，故高脂肪样品多选用气相色谱进行分离，而气相色谱－串联质谱因具有灵敏度高、选择性好、定量能力准确的特点被广泛应用于农药多残留检测［8－10］。本研究采用自动QuEChERS前处理设备，以PSA/C18/Z－Sep+为分散固相吸附剂，建立了基于QuEChER方法的气相色谱－串联质谱快速检测花生中297种农药的方法。所选取的297种农药包括氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、有机氮类、有机氯类、有机磷类和有机硫类等类别，实现了一种技术覆盖多类别农药的检测。参考GB2763－2019《食品安全国家标准－食品中农药最大残留限量》中花生最大残留限量标准所涉及的农药，本文所检测的农药数量多、类别广，能够为相关标准制定提供依据［11－12］。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent7890A－7000B气相色谱－三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；QuEChERS自动样品制备系统Sio-6512（北京本立科技公司）；自动QuEChERS整合管（包括外管和净化内管，北京本立科技公司）；N-112氮吹浓缩仪（美国Organomation Associates公司），TRIOTM－1N涡旋搅拌器（日本Asone公司），Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司），PL602－L电子天平（瑞士Mettler－Toledo公司），超声波清洗器（中国江苏昆山超声仪器有限公司）。

297种农药标准品（纯度≥95%，天津阿尔塔公司）；乙腈（色谱纯，美国Honeywell公司）；PSA、C18吸附剂（天津Bonna－Agela公司）；Z－Sep+（美国Supelco公司）；EMR－lipid（美国Agilent公司）。实验用水均为高纯水（经Milli-Q超纯水器纯化）。

1.2 标准溶液的配制

各称取10mg标准品于10mL容量瓶中，用甲醇准确定容至刻度，配制成1000mg/L的单标储备液，于－18℃下保存。从1000mg/L的单标储备液中各取100µL于10mL棕色容量瓶中，配制成10mg/L的混标贮备液，－18℃下保存。按需取适量标准储备液，配制成所需浓度的标准工作液，于4℃避光储存。

1.3 样品制备与提取净化

将花生仁用料理机粉碎，混匀，备用。准确称取2.00 g样品于配套试管的外管中，加入2mL水浸润30min后，加入15mL1%（体积分数）醋酸乙腈、4g硫酸镁、1g乙酸钠和12颗锆珠，将净化内管（内管中含100mg PSA，100mg Z－Sep+，200mg C18，400mg无水硫酸镁和6颗锆珠）置于外管中，振荡混匀后放入自动QuEChERS前处理设备，设置提取振荡程序进行处理。待处理完成后，取内管上清液2mL，在氮气气流下吹至近干，使用1mL乙酸乙酯定容，过0.22 µm滤膜，供GC－MS/MS测定。

1.4 色谱－质谱条件

色谱柱：HP－5MS UI气相色谱柱（30m×0.25 mm×0.25 µm，美国Agilent公司）；载气流速为1.2 mL/min；载气：氦气，99.999 %；柱温：初始温度40℃，保持1min，以30℃/min升温至130℃后，再以5℃/min升温至250℃，最后以10℃/min升温至300℃，保持8min；进样口温度：250℃；进样方式：不分流进样；溶剂延迟：4min；EI离子源温度：270℃；EI源电离能量：70eV；传输线温度：280℃；四极杆温度：150℃；碰撞气：高纯氮气（99.999%）；扫描模式：多重反应监测（MRM）模式。检测离子对及扫描时间见表1，297种农药残留的总离子流图见图1。

图1 花生中297种农药的总离子流图（0.1 mg/kg）Fig.1 Total ion chromatogram of297pesticides（0.1 mg/kg）in peanut

表1 297种农药的保留时间、MRM参数、线性范围、相关系数（r2）、花生基质的加标回收率（100µg/kg）和相对标准偏差（RSDs，n=6）及定量下限（LOQ）Table1 Retention times，MRM parameters，linear ranges，correlation coefficients（r2），recoveries（100µg/kg）and RSDs（n=6），and limits of quantitation（LOQs）of297pesticides

（续表1）

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2 结果与讨论

2.1 提取条件优化

2.1.1 提取溶剂种类优化花生基质成分复杂，提取剂在保证目标农药提取效率的同时应尽可能减少共萃物的萃取，减少基质干扰。乙腈通用性强，渗透性好，能有效降低油脂蛋白质和糖分的干扰［13］，已成为应用广泛的农药多残留提取剂。在乙腈作用下，某些碱敏感型农药易发生降解［14］，因此需在乙腈中加入适量醋酸调节pH值。本文考察了纯乙腈、1%（体积分数，下同）醋酸乙腈和2%（体积分数，下同）醋酸乙腈对花生中目标农药的提取效率，实验发现，以1%醋酸乙腈为提取剂时，目标农药回收率在70%～120%范围的数量高于乙腈和2%醋酸乙腈（图2），因此本实验选择1%醋酸乙腈作为提取试剂。

图2 目标农药在3种不同提取剂中的回收率Fig.2 Recoveries of target pesticides with three different extract solvents

2.1.2 提取溶剂用量优化提取剂的用量会对目标农药的回收率造成一定影响。本文分别比较了1%醋酸乙腈用量为10、15、20mL时，花生中目标农药的加标回收率情况。结果表明，用量为15mL和20mL时，目标农药回收率在70%～120%范围内的占比分别为74.5 %和72.5 %，均高于10mL时的占比（70.2 %）。最终选择1%醋酸乙腈的体积为15mL进行提取。

2.2 缓冲盐用量的优化

由于花生大多为干制品，水分含量较低，用1%醋酸乙腈提取时，不能很好地渗透到样品组织内部，导致部分农药回收率较低。因此，在提取过程中通常会加入一定量的水，但水分过多影响净化效果，且可能对仪器产生损害，而加入缓冲盐可以起到使水相与有机相分离并去除水分的作用。本文考察了2g硫酸镁+0.5 g乙酸钠、4g硫酸镁+1g乙酸钠和6g硫酸镁+1.5 g乙酸钠3种缓冲盐方案对花生中297种农药加标回收率的影响。

结果表明，使用2g硫酸镁+0.5 g乙酸钠时，样品与盐结合成团状，不能充分去除样品中水分，影响目标化合物的提取，且只有52.7 %的目标农药回收率在70%～120%；使用6g硫酸镁+1.5 g乙酸钠时，65.7 %的目标农药回收率在70%～120%；而使用4g硫酸镁+1g乙酸钠时，有83.0 %的农药回收率在70%～120%范围，较其它两种组合回收率提高了30.3 %和17.3 %，因此选择4g硫酸镁+1g乙酸钠作为缓冲盐。

2.3 净化剂的优化

2.3.1 净化剂种类的优化Z－Sep+是二氧化硅键合C18和ZrO2两种吸附剂的混合物，在酸性条件下，对带有负电荷的油酸、羧酸等阴离子具有很强的吸附作用，除油脂效果更理想［15］。另外，作为一种与Z－Sep+功能相似的吸附剂，增强型脂质吸附剂（EMR－lipid）可通过体积排阻与疏水作用将基质中体积较大且疏水的油脂类化合物分离，从而达到较好的净化效果［16－17］。

本文以1%醋酸乙腈为提取剂，在固定加入400mg无水硫酸镁的前提下［7，18］，考察了4种净化剂组合的净化效果：（1）100mg PSA+200mg C18；（2）100mg PSA+100mg Z－Sep+；（3）100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+；（4）EMR－lipid。

4种净化剂组合中目标农药回收率在70%～120%范围的比例依次为56.2 %、68.2 %、77.1 %和69.6 %，即使用组合（3）时回收率在70%～120%范围内的农药数最多。在100µg/kg添加水平下，将上述各净化剂组合样品同批次进样并进行对比，发现加入C18和Z－Sep+时化合物响应明显高于其他组合。以氯氟氰菊酯、α-六六六为例，其提取离子流色谱图如图3所示。因此选择100mg PSA+150mg C18+75mg Z－Sep+为最优净化剂组合。

图3 不同净化剂组合下氯氟氰菊酯、α-六六六在花生中的提取离子流色谱图Fig.3 Overlapped extract ion chromatograms of cyhalothrin and α-HCH in peanut sample after cleanup using different sorbents

2.3.2 净化剂用量的优化采用单因素实验法进一步优化了C18、Z－Sep+和PSA的添加量。固定加入400mg无水硫酸镁，分别比较了C18（100、200、300、400mg）、Z－Sep+（50、75、100、125mg）和PSA（50、100、150、200mg）添加量对农药回收率的影响。结果发现，当使用100mg PSA、200mg C18和100mg Z－Sep+时，目标农药的回收效果最好。因此，本研究最终采用100mg PSA+200mg C18+100mg Z－Sep+为净化剂。

2.4 基质效应

基质效应（ME）是指基质引起的检测信号的增强或者减弱现象，不同农药所受到的基质效应不同。本研究通过建立一系列基质标准曲线与溶剂标准曲线，按照公式ME（%）=100%×（A－B）/B（A为农药在基质匹配标准溶液中的响应值，B为农药在纯溶剂中的响应值）进行计算和基质效应评价。ME低于－20%时为基质抑制效应，在－20%～20%之间时为弱基质效应；大于20%为基质增强效应［19］。由图4可见，共有6种（2.02 %）农药表现为基质抑制，216种（72.73 %）农药表现为弱基质效应，75种（25.25%）农药表现为基质增强。因此本实验采用基质匹配标准曲线校正，以减弱基质效应对目标化合物定量的影响。

图4 花生中目标农药的基质效应Fig.4 Matrix effects（ME）of the test pesticides in peanut matrix

2.5 方法学评价

2.5.1 定量下限在最佳条件下，采用花生的空白基质溶液，准确配制0.6 ～50µg/L的基质匹配标准工作溶液，在GC－MS/MS上进行测定，以峰面积对质量浓度作标准曲线，得到297种农药的线性回归方程。各农药的线性范围、相关系数和定量下限（S/N=10）结果见表1。从表中可以看出，各农药在一定质量浓度范围内线性良好，相关系数均不低于0.995 ，定量下限为2～10µg/kg。

2.5.2 回收率与相对标准偏差选择花生空白样品，分别进行10、20、50、100µg/kg4个水平的加标回收实验，每个水平做6个平行样品。其平均回收率分别为72.7 %～116%、71.9 %～117%、73.2 %～112%和71.5 %～120%，相对标准偏差（RSDs）分别为0.90 %～15%、0.70 %～15%、0.60 %～14%和0.40 %～15%，满足农药多残留分析的要求。100µg/kg加标水平的数据结果见表1。

2.6 实际样品测定

应用所建立的方法对市售8批次花生样品进行检测，共6批次检出农药残留（表2），其中第2批次样品检出9种农药，为检出农药残留最多的批次，其总离子流图见图5。所有样品中共检出17种农药残留，且百治磷、咪鲜胺和唑禾草灵的检出频次较高。总体而言，花生中的农药整体残留水平较低。

图5 检出9种农药的花生样品的总离子流图Fig.5 Total ion chromatogram of peanut samples with9pesticides detected No.were the same as those in Table1

表2 花生中农药检出情况Table2 Detection results of pesticide residues in peanut

(续表2)

3 结 论

本文在QuEChERS的基础上对提取和净化步骤进行优化，联合PSA、C18和Z－Sep+进行净化，显著提高了回收率，并将QuEChERS方法与自动QuEChERS前处理设备结合，极大地提高了工作效率。与传统QuEChERS方法相比较，本方法在保证回收率与精密度的基础上，自动化程度更高，处理批量样品的耗时更短，为快速测定花生中的多农药残留提供了有力的技术手段。