珍珠层粉复合富血小板纤维蛋白对颅骨缺损模型兔的修复作用

2021-10-16马福娟MAGEDALIAlAroomi王触灵谢富强

吉林大学学报（医学版） 2021年5期

黄莹 ,马福娟 ,MAGED ALI Al-Aroomi ,王触灵 ,谢富强,

（1.兰州大学第二医院口腔科，甘肃兰州 730000；2.兰州大学口腔医学院，甘肃兰州 730000；3.武警甘肃总队医院口腔科，甘肃兰州 730000）

颌面部肿瘤、外伤和感染等是造成口腔颌面部缺损的常见原因。颌骨缺损后会影响患者的咀嚼、语言、吞咽和呼吸等功能，严重影响患者心理健康及生存质量。自体骨移植一直被认为是修复颌骨缺损的金标准，其优点为排斥反应小，价格便宜，自体移植失败的主要原因是移植物坏死，通常是由血液供应不佳和继发感染所引起［1］。同种异体骨、异种骨和合成骨移植也可用于颌骨缺损后的修复材料，但异体、异种移植物存在疾病传播以及免疫排斥反应等问题［2］。近年来，生物工程材料被广泛应用于颌骨缺损修复研究，不仅具有良好的生物相容性，且可以促进骨形成［3］。由软体动物产生的珍珠层粉（nacre powder，NP）已成为一种具有潜力的骨替代品，其主要成分为碳酸钙、1%～5%有机成分（可溶性和非可溶性）和微量元素等，是良好的成骨材料之一［4］；富血小板纤维蛋白（plateletrich fibrin，PRF）是自体来源的富血小板纤维蛋白，被称为第2 代浓缩血小板，是由未添加任何生物制剂的自体外周血离心后产生的，相较第1 代浓缩血小板富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP），PRF 制备简单且排除了免疫排斥反应等问题，并且是一种密集的纤维蛋白网状支架，由四分子结构的纤维基质蛋白聚合而成，含有生长因子、血小板和白细胞等成分［5］。PRF 富含血小板生长因子、生长转化因子、表皮生长因子和血管内皮细胞生长因子等多种生长因子，可促进骨组织和软组织创面再生，在口腔颌骨缺损修复、种植牙拔牙位点保存和软硬组织增量、整形美容和创面修复等领域得到越来越广泛的应用［6］。NP 不仅具有无机材料的机械性质，而且还含有可通过骨诱导促进成骨的有机基质，用作机械支撑和钙储存；PRF 具有三维网状结构，不仅含有多种促进成骨的生长因子，且无免疫排斥反应，是移植过程中骨再生和骨修复的生长因子来源，在骨骼愈合过程中起着核心作用。本实验探讨了PRF 与NP 混合，发挥2 种材料各自不同的优点，以克服单一材料骨缺损修复的不足，阐明了对NP复合PRF材料成骨的效果，为今后该复合物用于颌骨缺损修复提供有力的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器12 只新西兰兔均来自解放军联勤保障940 医院动物实验中心，实验动物使用许可证号：SYXK（军）2012-0029。NP（细度500 目，青岛捷世康生物科技有限公司），骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）兔多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），组织切片机（德国徕卡仪器有限公司），光学显微镜（浙江舜宇光学有限公司）、Micro CT系统（美国铂金埃尔默股份有限公司）。

1.2 PRF 复合材料的制备兔耳中央动脉的末端区域脱毛消毒后，抽取5 mL 血液，2 700 r·min－1离心12 min，制备出PRF，无菌剪刀将PRF 凝块剪碎。珍珠层粉用20 kGy Co60 辐照灭菌后备用，将消毒后的珍珠层粉与PRF 凝块按2∶1 质量比例混合后置于直径为8 mm、厚度为1 mm 的圆形模子中，成型后取出备用。

1.3 实验动物模型的建立健康成年新西兰大耳白兔，体质量为2.1～2.7 kg，共12 只。颅骨顶部矢状缝周围3 cm×3 cm 区域脱毛处理，耳缘静脉推注3%戊巴比妥钠（3 mL·kg－1），全身麻醉后，术区消毒，切开并剥离骨膜，于矢状缝两侧造成4 个直径为8 mm 的全层骨缺损，保留完整的硬脑膜。按颅骨缺损部位植入物不同分为4 组，分别等量植入各组成骨材料于缺损区：空白对照组、NP 组、PRF 组和复合组，每组3 只新西兰兔。术后3 d 肌肉注射庆大霉素（8 万U·kg－1）。分别于4、8 和12 周各处死4 只新西兰兔。取出缺损颅骨待检测。

1.4 大体观察术后观察各组新西兰兔饮食情况及创口反应情况；肉眼观察植入材料表面情况、缺损区骨痂量和骨的厚度。

1.5 Micro CT 扫描检测各组新西兰兔骨质状况4%甲醛固定，采用高分辨率离体活体二合一Micro CT 仪器，Micro CT 扫描后三维重建，通过Analyze 12.0 分析软件分离选择的三维区域数据，分别测定骨矿物质密度（bone mineral density，BMD）以及新生骨体积/骨总体积百分数（bone

volume/ tissue volume，BV/TV）。

1.6 HE 染色观察各组新西兰兔颅骨组织病理形态表现切取新西兰兔的颅骨，在10%甲醛溶液中固定并洗涤，EDTA 脱钙，逐级乙醇脱水，浸蜡，包埋，进行HE 染色，观察各组兔颅骨缺损部位骨组织病理形态表现。

1.7 免疫组织化学法检测新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 和VEGF 蛋白表达水平免疫组织化学检测各组兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 和VEGF 蛋白表达情况。一抗孵育VEGF（1∶200）和BMP-2（1∶200），滴加二抗和三抗孵育，冲洗，显色。取同等倍数下的4 个不同视野进行拍照，Image Pro Plus 软件测量蛋白表达的积分光密度值（integrated optical density，IOD）和面积，计算平均光密度值（optical density，OD），OD=IOD/面积，以OD 值代表目的蛋白表达水平。

1.8 统计学分析采用SPSS 19.0 统计软件进行统计学分析。采用Graphpad Prism 6 软件绘图。各组新西兰兔颅骨缺损部位新骨的BMD 和BV/TV，BMP-2 和VEGF 蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功制备PRF抽取新西兰兔血液离心后，血液共分3 层：上层为血浆层，中间层为PRF 凝块层，下层为红细胞层。取出中间层即为PRF（图1）。

图1 5 mL 血液离心后形成的PRFFig.1 PRF formed by centrifugation of 5 mL blood

2.2 大体观察建立新西兰兔颅骨缺损模型，并于4 个缺损部位按分组植入材料（图2 和3）。术后新西兰兔生命体征平稳，体质量逐渐增加，术区无肿胀，均存活至预定取材时间。大体观察可见所有新西兰兔颅骨缺损部位均有中央凹陷及边缘成骨，但复合组新西兰兔颅骨缺损部位较NP 组、PRF 组和空白对照组成骨明显丰满。

图2 新西兰兔颅骨缺损模型的制备Fig.2 Preparation of cranial defect model of New Zealand rabbit

图3 各组新西兰兔颅骨缺损区植入物Fig.3 Implants in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups

2.3 Micro CT 扫描检测新西兰兔骨质情况CT三维重建结果显示：4 周时复合组和NP 组新西兰兔颅骨缺损区边缘成骨较空白对照组和PRF 组明显，但复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨面积更大；8 周时复合组新西兰兔颅骨缺损部位边缘及中央均有明显新骨形成，但复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨面积更大；12 周时复合组新西兰兔颅骨缺损部位形成新骨几乎填满缺损部位，而空白对照组、NP 组和PRF 组新西兰兔颅骨均有明显骨缺损影像（图4）。Micro CT 扫描检测结果显示：复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨的BMD 和BV/TV均较空白对照组、NP 组和PRF 组明显升高（P＜0.05），表明复合材料可明显促进新骨的形成（表1 和2）。

表1 各组新西兰兔骨矿物质密度Tab.1 BMD of rabbits in various groups (n=12，x±s，mg·cm－3）

图4 Micro CT 扫描技术检测新西兰兔颅骨缺损部位新骨形成三维重建图像Fig.4 Three dimension reconstruction photos of formation of new bone in cranial defect areas of New Zealand rabbits detected by of Micro CT scan

表2 各组新西兰兔新生骨的BV/TVTab.2 BV/TV of rabbits in various groups（n=12，x±s，η/%）

2.4 各组新西兰兔颅骨缺损区成骨情况4 周时，复合组新西兰兔颅骨缺损部位内新生骨内有大量的骨细胞和类骨质形成，大量新生血管生成，成骨细胞增生活跃；8 周时，复合组新西兰兔颅骨缺损部位成骨细胞增生，新生骨明显矿化且排列稍紊乱，有初级骨小梁形成，新生血管增多，可见骨化中心；12 周时，复合组新西兰兔颅骨缺损部位有骨矿化，形成更多骨小梁，骨质成熟，成熟的骨质中骨细胞排列有序，新生血管多，骨缺损边缘多见成骨细胞，成骨细胞增生活跃（图5）。

图5 4、8 和12 周各组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织病理形态表现（HE，×20）Fig.5 Morphology of bone tissue of cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks（HE,×20）

2.5 各组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 和VEGF 蛋白表达水平4、8 和12 周时复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 抗体（图6）和VEGF 抗体（图7）阳性棕色染色较空白对照组、NP 组和PRF 组明显。4、8 和12 周时，与空白对照组比较，复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 和VEGF 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）。见表3 和表4。

表3 4、8 和12 周时各组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 蛋白表达水平Tab.3 Expressions level of BMP-2 protein in new bone tissue in cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

*P＜0.05 vs blank control group.

表4 4、8 和12 周时各组新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中VEGF 蛋白表达水平Tab.4 Expressions level of VEGF protein in new bone tissue at cranial defects of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (n=12，）

*P＜0.05 vs blank control group.

图6 4、8 和12 周新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中BMP-2 蛋白表达情况(免疫组织化学，×40)Fig.6 Expressions of BMP-2 protein in new bone tissue in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (Immunohistochemistry,×40)

图7 4、8 和12 周新西兰兔颅骨缺损部位新骨组织中VEGF 蛋白表达情况(免疫组织化学，×40)Fig.7 Expressions of VEGF protein in new bone tissue in cranial defect areas of New Zealand rabbits in various groups at 4,8,and 12 weeks (Immunohistochemistry,×40)

3 讨论

颌骨缺损修复一直以来是困扰颌面外科医生的难题，寻找一种有效的具有诱导成骨作用的骨替代材料是近年来很多学者研究的重点。本研究中NP的主要成分为碳酸钙，为修复材料提供了成骨的主要成分，PRF 则提供了成血管的主要生长因子，两者混合后成骨效果更明显。本研究采用NP 和PRF 成功制备出具有成骨作用和骨诱导作用的骨替代物，并在动物实验中验证该复合材料较单纯材料的成骨作用更加明显，为颌骨缺损修复材料提供理论基础及新思路。

颅骨缺损是目前公认最具有选择性的骨诱导模型，兔颅骨缺损模型已被用来评估不同植骨材料和生长因子的骨再生潜力的模型［7］。该实验模型适合于评估各种生物材料对骨再生的影响［7-8］，并且手术操作简单，组织标本较易制取，因此兔颅骨缺损作为颌骨缺损的模型，可集中观察复合材料骨诱导的情况，是本实验的最佳动物模型。本实验选择新西兰兔作为实验动物是因其可以提供足够的血液制作PRF，且兔骨骼发育与人类相似。兔颅骨缺损的尺寸为11 mm［9］，但考虑到减少个体间的差异、实验的时长和研究目的等因素，故采用8 mm 的颅骨缺损。本研究中兔颅骨缺损模型的空白对照组于术后12 周时并未完全愈合，因此本实验采用了8 mm 的兔颅骨缺损，并将愈合期设定为12 周，更符合生物学过程。

本实验通过Micro CT 扫描、HE 染色以及免疫组织化学等方法来研究NP 复合PRF 复合材料的成骨能力。本研究中Micro CT 扫描三维重建结果显示：复合组新西兰兔颅骨缺损部位的成骨面积在8 周前新骨面积增长较缓慢，而到12 周时则新骨面积增长较快；12 周时NP 组与复合组新西兰兔颅骨缺损部位新骨形成面积相当，两者的BMD 和BV/TV 的比较差异有统计学意义，表明NP 组单独植入时新骨的BMD 与复合组相差较小。前期研究［10］表明：NP 可促进成骨细胞分化并加速其矿化。本研究中复合组新西兰兔在4～8 周BMD 和BV/TV增加较慢，而至12 周时，BMD 和BV/TV 增加较快，与以上研究结论一致，初步验证了复合材料后期成骨能力较强。研究［11］显示：PRF 能够在骨移植愈合早期形成新骨。另外，NP 的降解性较差，后期成骨则主要依靠NP 可溶性有机基质（water soluble matrix，WSM）［11］。本研究中，第8 和12 周时，虽然NP 组成骨面积、BMD 增长较复合组稍低，但较PRF 组和空白对照组明显升高，与复合组增长趋势相当，可能与WSM 能够增加BMD 有关［11］；NP 组和复合组较PRF 组和空白对照组成骨效果明显，则表明NP 在复合组中成骨效果更加持久。因WSM 可明显上调有丝分裂原活化蛋白激酶（MEK）/细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路，并且明显提高成骨分化标志物蛋白表达水平，其中包括Ⅰ型胶原蛋白、runt相关转录因子2（RUNX2）、分泌磷蛋白1（SPP1）和碱性磷酸酶（ALP），故骨再生效果明显［11］。而PRF 组的BMD 和BV/TV总体增长较慢，可能与PRF 释放生长因子的高峰为7～14 d 有关［12-13］。本研究中HE 染色也支持Micro CT 扫描检测结果，8～12 周复合组和PRF 组新西兰兔新骨组织中成骨细胞活性明显增加，表明NP 可激发成骨细胞活性。NP 刺激细胞活性是由于其中含有一种或多种信号分子可促进骨形成，WSM 蛋白可以直接通过刺激成骨细胞功能，间接诱导合成纤维基质蛋白（Ⅰ型胶原蛋白）来促进骨生成［14］。后期NP 的WSM 扩散增加，故骨再生后期成骨细胞增生活跃。

在骨修复再生过程中，VEGF 是一种有效的血管生成诱导物，参与血管形成的早期阶段，诱导血管快速生长，形成的毛细血管为骨修复部位的细胞提供必要的营养来促进愈合过程，因此在骨再生和骨修复中VEGF 起着关键作用，可作为评价成骨效果的指标之一［15-17］。研究［18］显示：在成骨细胞分化早期，VEGF 的表达水平较低，在成骨细胞分化的最终阶段，VEGF 的表达水平明显升高，在组织矿化过程中达到高峰。这与本实验复合组新西兰兔颅骨缺损区新骨组织中VEGF 表达趋势一致，表明复合物在骨形成的整个过程中可持续刺激血管的生成。本研究结果显示：在第4 周时，PRF 组的VEGF 的表达水平仅次于复合组，可能与PRF 可直接释放VEGF 有关。本研究同样也观察到复合物可以促进BMP-2 的表达。BMPs 在成骨和骨再生塑形方面具有重要作用，参与细胞有丝分裂、趋化和细胞分化，且该蛋白具有骨诱导能力。BMPs 是属于转化生长因子（TGF）家族的一类多功能细胞因子家族，不仅是促进成骨细胞增殖、分化及矿化的有效调节因子，而且可使VEGF 的分泌增加［18］。其中，BMP-2 还可促进MSCs 向软骨细胞和成骨细胞分化［19］。VEGF 和BMP-2 在骨再生修复中的功能是协调互补的，BMP-2 虽然不能直接诱导血管形成，但可以促进VEGF 表达的增加，继而通过间接促进血管形成，以起到加速骨再生修复的作用；而VEGF 可促进软骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的增殖和分化，并通过上调BMP-2 的表达，从而促进MSCs 向软骨细胞和成骨细胞的分化［19］。因此推测本研究中复合物修复新西兰兔颅骨缺损可能诱导增加了VEGF 和BMP-2 的表达，促进血管生成，能够较好地促进成骨细胞分化和矿化，从而增加颅骨缺损表面的血液供应和成骨能力，促进新骨的形成。

虽然NP 和骨骼矿物成分的有机基质与矿物的比例不同，但其均由具有微结构的复合矿化基质组成，体内和体外研究均提示其具有良好的骨诱导、骨传导和生物相容性等特性［4］，可能是该复合物具有良好成骨作用的原因之一。前期研究［6］结果显示：NP 在第4 周对人骨细胞（HBCs）的成骨促进作用较磷酸三钙强。本研究中NP 组在第4 周，成骨效果较对照组和PRF 组明显，但复合组成骨效果更明显。

PRF 的成分与其特殊的结构有利于细胞黏附，并促进骨髓干细胞向成骨细胞分化［20］。软硬组织修复与细胞的分裂、增殖、分化和凋亡有密切关联，而上述过程可受到PRF 中相关生长因子的相互协作及有效的调控，促进胶原的合成、血管生成长入和诱导细胞分化，从而促进软硬组织愈合［21］。目前研究均证明NP 和PRF 具备良好的骨诱导和骨传导能力，并为本研究的结果提供支撑。

综上所述，NP 复合PRF 复合材料，不仅能够在早期释放生长因子促进骨再生，还能够在骨再生后期很好地刺激血管再生并促进骨组织的矿化，能够加速骨再生。本课题组将在后续的实验中，将NP 和PRF 复合制备成有孔材料更好地促进骨再生，同时检测有孔复合材料的理化性质和生物学机制。