人参二醇诱导3T3-L1 脂肪前体细胞凋亡及其作用机制

赵 岩 ,于鹏程 ,王 禹 ,王英平 ,李平亚 ,刘金平

（1.吉林农业大学中药材学院人参新品种选育与开发国家地方联合工程研究中心，吉林 长春 130118；2.吉林大学药学院人参创新药物开发国家地方联合工程研究中心，吉林 长春 130021）

随着时代的发展，全球肥胖人数明显增加。肥胖作为一种全球流行性疾病，现已成为危害人类健康的主要杀手［1］。肥胖不是一种独立疾病，其对健康的影响不仅包括引起机体代谢紊乱，还会引发一系列高危疾病，如心血管疾病［2］、2 型糖尿病［3］、呼吸系统疾病［4］和癌症［5］等。此外，不断升高的肥胖率和人口老龄化也是人类社会年龄相关疾病发病率不断上升的主要原因。肥胖和衰老有一系列共同病理生理学特征，包括脂肪组织功能障碍［6］、低度炎症［7］、固有免疫和适应性免疫应答受损［8］等。肥胖对人类健康、经济和社会产生的影响，表明其已成为严重的公共威胁。在众多减肥方法中，虽然通过饮食控制和体育锻炼可以控制体质量并达到减脂的效果，但需要强大的自制力和长期的坚持，多数人无法坚持。因此，药物减肥仍是目前最有效的手段，其中人参皂苷（元）是近年来抗肥胖研究的热点［9］，其大多通过抑制脂肪细胞分化而发挥抗肥胖作用，而通过诱导脂肪细胞凋亡抗肥胖的人参皂苷类成分却少有报道。人参二醇（panaxadiol，PD）是达玛烷型人参皂苷二醇型人参皂苷元经侧链环合形成的产物，具有抗肿瘤［10］和抗心肌损伤［11］等作用。PD 能够诱导结肠癌细胞HCT-116和SW-480 的凋亡［10］，但其对脂肪细胞的作用却未见报道。因此，本研究采用不同浓度PD 处理3T3-L1 脂肪前体细胞，从细胞凋亡的角度探讨PD对脂肪细胞的影响，为人参皂苷在抗肥胖领域中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂和仪器3T3-L1 脂肪前体细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（GNM25）；PD（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，DMEM 培养基购自海克隆生物化学制品（北京）有限公司，胎牛血清购自Clark 生物科技有限公司，双抗、胰蛋白酶、胰蛋白酶（不含EDTA）、PBS 缓冲液、10×电转液、10×TBST 缓冲液、30%制胶液、1 mol·L－1Tris-HCl缓冲液、1.5 mol·L－1Tris-HCl 缓冲液、脱脂奶粉和羊抗兔二抗均购自北京索莱宝科技有限公司，地塞米松（DEX）购自上海九鼎化学科技有限公司，重组人胰岛素购自武汉普诺赛生命科技有限公司，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）购自上海麦克林生化科技有限公司，CCK-8 购自美国GLPBIO 公司，RIPA 裂解液、BCA 试剂盒和ECL 化学发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，磷酸肌醇3 激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）抗体、磷酸化磷酸肌醇3 激酶（p-PI3K）抗体、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）抗体、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体、B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗体、Bcl-2 相 关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗体及裂解的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（cleaved-Caspase 3）抗体均购自武汉Proteintech 公司，即用型PI 染色液购于北京酷来搏科技有限公司，即用型DAPI 溶液购自北京索莱宝科技有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒购于贝博生物科技有限公司；AvantiTMJ-3OI 冷冻离心机购于海南赫敏仪器有限公司，Spectra MAX 190 酶标仪购于上海美谷分子仪器有限公司，BD FACSVerse 流式细胞仪购于美国Betcon Dickinson公司，ChemStudio SA2 显影仪购于德国Analytik Jena AG 公司

1.2 3T3-L1 细胞的培养及诱导分化3T3-L1 脂肪前体细胞常规复苏后，采用含10%胎牛血清、100 U·mL－1青霉素以及100 U·mL－1链霉素的高糖DMEM 培养基（完全培养基）在37 ℃、5%CO2条件下培养，每48 h 更换一次培养基。待细胞达到70%～80%密度后，用0.05%胰蛋白酶1∶5 消化传代培养。细胞传代后，每48 h 更换一次培养基，待细胞接触抑制，即融合度达到100%后，更换新鲜的完全培养基继续培养48 h。之后移除培养基，加入分化培养基（含有10 mg·L－1胰岛素、500 μmol·L－1IBMX 和1 μmol·L－1DEX 的完全培养基）继续培养，在48 h 后更换为维持培养基（含有10 mg·L－1胰岛素的完全培养基）继续培养48 h，48 h 后更换为普通的完全培养基，随后每48 h 更换一次完全培养基，共诱导分化8 d 后，在显微镜下观察，若细胞质内已形成明显脂滴，则细胞已分化为成熟脂肪细胞。

1.3 CCK-8 法检测各组细胞活性采用CCK-8 法检测3T3-L1 脂肪前体细胞（未分化）和成熟脂肪细胞（分化细胞）的细胞活性。将处于不同生长期的3T3-L1 脂肪前体细胞消化后，离心、重悬使其成为均匀的混悬液，将细胞浓度稀释至每孔5×103个，均匀地接种于96 孔细胞培养板中继续培养，待细胞贴壁后长至70%～80%时，弃掉上清，用以培养基配置好的不同浓度PD 溶液（0、1、5、10、25、50 和100 μmol·L－1）处理细胞24 h。每孔加 入10 μ L CCK-8，孵 育2 h，酶标仪于波长450 nm 检测吸光度（A）值。细胞活性=（给药组A 值－空白孔A 值）/（对照组A 值－空白孔A 值）×100%。

1.4 DAPI 荧光染色观察细胞形态取对数生长期3T3-L1 脂肪前体细胞，以每孔5×104个细胞的密度接种于6 孔细胞培养板中，于37 ℃、5%CO2培养箱培养约24 h，弃去旧培养基，每孔加入2 mL 含（0、5、25 和50 μmol·L－1）PD 的培养基处理细胞24 h。取出6 孔细胞培养板，弃去含药培养基，用预冷的PBS 缓冲液洗涤2～3 次（每次5 min），用4%多聚甲醛固定细胞10～15 min 后，弃固定液，以预冷PBS 缓冲液洗涤2 次，随后每孔加入2.5 mg·L－1DAPI 500 μL，于37 ℃避光条件下染色15 min。染色结束后弃去剩余染液，以预冷PBS 缓冲液洗涤2 次，于倒置荧光显微镜下观察细胞核形态并拍摄。

1.5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率取生长状态良好的3T3-L1 脂肪前体细胞，以每孔5×104个细胞的密度接种于6 孔细胞培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养约24 h，随后更换含不同浓度（0、5、25 和50 μmol·L－1）PD 的培养基处理3T3-L1 24 h，弃去旧培养基，用PBS 缓冲液润洗2 次以除去残余培养基，加入不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，调整细胞浓度为每毫升（1～5）×106个细胞，用预冷的PBS 缓冲液洗涤细胞2 次（每次2 mL），离心，弃去上清，加入400 μL Annexin Ⅴ结合液悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入5 μL AnnexinⅤ-FITC 染色液，避光条件下孵 育15 min，加入10 μL 碘化丙啶（PI）染色液轻轻混匀，于避光条件下孵育5 min，立即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.6 流式细胞术检测各组细胞周期分布采用PI染色法检测细胞的周期分布。将细胞以每孔5×104个的密度接种于6 孔细胞培养板中，于37 ℃、5 % CO2培养箱中培养约24 h，随后更换含不同浓度（0、5、25 和50 μmol·L－1）PD 的培养基处理3T3-L1 脂肪前体细胞24 h，将细胞用不含EDTA的胰酶消化、洗涤后，收集并固定在70%冰冷乙醇中，－20 ℃条件下过夜。待到检测时，将细胞离心洗涤后，用PI 染液（50 mg·L－1）对细胞进行染色，避光孵育30 min，随后立即用流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.7 Western blotting 法检测各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平3T3-L1 脂肪前体细胞给药24 h 后，正确用预冷的PBS 缓冲液润洗3 次，RIPA 裂解液提取总蛋白，离心除去杂质，随后用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，PBS 缓冲液调节蛋白浓度至统一，以5×蛋白上样缓冲液与蛋白样品按1∶4 比例混合，沸水浴中加热10 min 使蛋白完全变性，上样。在SDS-PAGE 胶上进行蛋白分离，转印至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h 后用TBST 缓冲液洗涤3 次，加入TBST 缓冲液配制的一抗在4 ℃条件下孵育过夜。TBST 缓冲液洗膜3 次后，加入二抗室温孵育2 h 后洗膜3 次。采用ECL 化学发光试剂盒和显影仪显色拍照，Image J软件分析灰度值，计算目标蛋白表达水平。目标蛋白表达水平=目标蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.8 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0.1 统计软件进行统计学分析。各组细胞活性、细胞凋亡率、不同细胞周期细胞百分率和凋亡相关蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3T3-L1 脂肪前体细胞的诱导分化将未分化的细胞置于倒置显微镜下观察，此时可以观察到细胞呈梭形，胞内未见明显黄色油滴（图1A）。细胞在诱导分化之前必须使其接触抑制，目的是让细胞退出分裂期，使其进入分化阶段，此时可见细胞体积较之前略有膨大，总体呈类椭圆形（图1 B）。当细胞接触抑制后，加入诱导剂诱导其分化，细胞逐渐收缩变圆，胞内慢慢出现黄色脂滴，并随诱导时间的延长而变大（图1C～1E）。诱导分化8 d 后，可见细胞明显膨大变圆，视野内可见大片黄色油滴，此时细胞分化成熟（图1 F）。

图1 3T3-L1 脂肪前体细胞分化后形态表现（×50）Fig.1 Morphology of 3T3-L1 preadipocytes after differentiation(×50)

2.2 各组3T3-L1 脂肪前体细胞的细胞活性与空白对照组比较，3T3-L1 脂肪前体细胞经不同浓度（1、5、10、25、50 和100 μmol·L－1）PD 处理后，10～100 μmol·L－1PD 处理组细胞活性明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），且呈浓度依赖性。与空白对照组比较，不同浓度PD 处理组成熟的脂肪细胞活性差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。因此，仅选择3T3-L1 脂肪前体细胞作为模型组进行后续实验研究。

图2 各组细胞活性Fig.2 Cell viabilities in various groups

2.3 各组3T3-L1 脂肪前体细胞形态表现DAPI荧光染色结果见图3，红箭头所指处为凋亡细胞。与空白对照组比较，5、25 和50 μmol·L－1PD 处理组3T3-L1 脂肪前体细胞数量减少，亮度增加，细胞轮廓变得不规则，出现核碎裂，且能够观察到凋亡小体与染色质碎片。细胞所呈现的凋亡特征随着给药浓度的升高而更加明显，表明PD 引起3T3-L1脂肪前体细胞的凋亡，并呈现浓度依赖性。

图3 DAPI 染色检测3T3-L1 前脂肪细胞的形态表现（×50）Fig.3 Morphology of 3T3-L1 preadipocytes detected by DAPI staining（×50）

2.4 各组3T3-L1 脂肪前体细胞凋亡率流式细胞仪检测细胞凋亡率的结果（图4）与荧光染色结果基本一致。与空白对照组比较，3T3-L1 脂肪前体细胞经不同浓度（5、25 和50 μmol·L－1）PD 处理后，25 和50 μmol·L－1PD 处理组细胞凋亡率升高（P＜0.01），且呈现明显的浓度依赖性。

图4 各组3T3-L1 脂肪前体细胞的凋亡率Fig.4 Apoptotic rates of 3T3-L1 preadipocytes in various groups

2.5 各组不同细胞周期3T3-L1 脂肪前体细胞百分率与空白对照组比较，不同浓度PD 处理组G0/G1期细胞百分率明显降低，且50 μmol·L－1PD处理组G0/G1期细胞百分率降低（P＜0.05），S期细胞百分率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），G2期细胞百分率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5。说明PD 可以诱导3T3-L1 脂肪前体细胞发生S 期阻滞，并且这种阻滞效应呈浓度依赖性。

图5 各组不同细胞周期3T3-L1 脂肪前体细胞百分率Fig.5 Percentages of 3T3-L1 preadipocytes in different cell cycles in various groups

2.6 各组细胞中凋亡相关蛋白表达水平与空白对照组比较，25 和50 μmol·L－1PD 处理组细胞中Bax 和cleaved-Caspase 3 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达水平，p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 比值明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图6。

图6 各组3T3-L1 脂肪前体细胞中凋亡相关蛋白的蛋白表达情况Fig.6 Expressions of apoptosis-related proteins in 3T3-L1 preadipocytes in various groups

3 讨论

脂肪细胞在能量平衡中起着至关重要的作用，当脂肪前体细胞分化为成熟脂肪细胞后，脂肪细胞数量增多，脂肪组织增长，引发肥胖。传统减肥方法主要是降低能量摄入和加强锻炼以加速脂肪细胞的代谢，使脂肪细胞体积减少以达到减肥的目的，但是细胞数量并未减少，当能量摄入较多时肥胖极易复发［12］。因此，在脂肪细胞分化成熟之前诱导其凋亡对抗肥胖的研究是有实际意义的。脂肪细胞实验的体外细胞培养模型包括干细胞、脂肪前体细胞和原代培养的前脂肪细胞，脂肪前体细胞系是目前应用最广泛的细胞模型［13］，其中3T3-L1 脂肪前体细胞是转化率最高、最具特性和最稳定的细胞株之一［14］，该模型可以使实验结果更加稳定。因此，本实验以小鼠3T3-L1 脂肪前体细胞作为体外细胞培养模型，研究PD 的诱导凋亡作用。

本研究细胞活性检测结果表明：PD 抑制了3T3-L1 脂肪前体细胞的细胞活性，而对成熟的脂肪细胞活性无明显影响，研究［15］表明：柚皮苷能够诱导成熟脂肪细胞的凋亡，而对脂肪前体细胞的生存能力无明显影响，说明同一物质对不同分化状态的脂肪细胞的调控作用可能存在差异。本研究中DAPI 染色和流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布的结果表明：当3T3-L1 脂肪前体细胞经PD处理后，细胞形态呈现了明显的凋亡特征变化，细胞凋亡率升高并且细胞于S 期受到阻滞，进一步确证了PD 对3T3-L1 脂肪前体细胞凋亡的诱导作用。

细胞凋亡是细胞受遗传因素控制，为了维持机体正常生命活动而引发的程序性的细胞死亡。对于脂肪细胞来说，许多天然活性物质都可以作用于凋亡过程中的多个信号通路，如白藜芦醇能够引起脂肪细胞促凋亡蛋白Bax 的表达水平升高，并引起抑凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平降低［16］；柚皮苷能够上调Bax 和APAF-1 的蛋白表达来诱导3T3-L1 成熟脂肪细胞凋亡［15］。本研究结果显示：PD 上调了脂肪前体细胞中Bax 和cleaved-Caspase 3 等促凋亡蛋白的表达，并且抑制了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 和Bcl-2 蛋白的表达，表明PD 可能通过PI3K/AKT 信号通路诱导脂肪细胞凋亡。人参皂苷Rh2 能通过AKT/Bax/caspase 9 信号通路诱导急性早幼粒白血病细胞系NB4 细胞凋亡［17］；人参皂苷Rk1 能通过PTEN/PI3K/AKT/mTOR 信号通路诱导MCF-7 细胞凋亡［18］。虽然本研究与上述研究中的细胞类型有差异，但本研究中PD 通过影响脂肪前体细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Bax、Bcl-2 以及cleaved-Caspase 3 蛋白表达水平诱导3T3-L1 脂肪前体细胞凋亡的实验结果与上述研究结果类似。此外，人参皂苷类物质的抗肥胖作用还与抑制脂肪细胞分化有关，如人参皂苷Rg2［19］和Rg3［20］等通过激活AMPK 信号通路抑制3T3-L1脂肪细胞的分化；人参皂苷Rg1 通过激活3T3-L1中C/EBP 同源蛋白10 抑制脂肪细胞发育的早期阶段，并且能够降低高脂饮食诱导的肥胖斑马鱼中脂肪的积累［21］，但PD 对上述信号通路的调控作用尚需进一步探究。

综上所述，本研究为PD 对肥胖的治疗提供了理论和实验依据，但仍存在诸多不足，未来应进行更多的动物实验和临床研究探讨PD 抗肥胖的具体机制，为肥胖的治疗提供新方案。