血红栓菌对斑马鱼的毒性效应及有效成分研究

毛可红 陈俏彪

（丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000）

血红栓菌[Trametes sanguinea(L.ex Fr.) Lloyd]是多孔菌科的野生高等真菌，药食两用，多生长于杨、柳、栎、枫、槭、桂树等阔叶树枯立木、倒木、伐木桩上，分布范围广。据记载，血红栓菌有清热解毒、消炎除湿等功效，可用于治疗咽喉肿痛、跌打损伤、痈疽疮疖、风湿痹症等症[1]。其子实体富含三萜、多糖、甾醇等多种活性成分，其中血红栓菌多糖对小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水瘤的抑制率可达90%[2]，且对食管癌、贲门癌有良好疗效，另可增强机体免疫力[3]。目前，有关血红栓菌的研究报道仍较少。

血红栓菌菌丝体呈淡桔红色，有些品种的子实体形状不规则，似牛樟芝，两者很容易混淆，甚至有商家以血红栓菌冒充牛樟芝出售。斑马鱼与人类基因的同源性较高，其与人类的同源疾病相关基因高达84%[4]，是仅次于小鼠的第二大模型生物，因其体积小、发育快、易观察、繁殖周期短等优点，常被应用于药物的安全性与毒性评价试验[5]。

本文对血红栓菌的主要有效成分进行检测，并委托上海南方模式生物科技股份有限公司以斑马鱼为给药对象，以市面上常见的3种牛樟芝为对照样品，进行急性毒性试验，以期为血红栓菌资源的合理开发利用提供参考。

1 材料与设备

1.1 试验材料

血红栓菌子实体（特红）由丽水职业技术学院真菌研究所提供，牛樟芝（白、黄、特白）子实体购自台湾，均粉碎机粉碎处理备用。

野生型AB品系斑马鱼由上海南方模式生物科技股份有限公司提供。

1.2 试验试剂

无水葡萄糖标准品（天津市科密欧化学试剂有限公司）、齐墩果酸标准品（纯度≥98%，四川省维克奇生物科技有限公司）。蒽酮、乙醇、硫酸、香草醛、甲醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸铜、氢氧化钠等均为分析纯。

1.3 仪器与设备

中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平（天津菁海仪器有限公司）、T6紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、HH-4水浴锅（常州国华电器有限公司）、L535R台式大容量冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机、QT-1涡旋混合器（上海琪特分析仪器有限公司）。

2 试验方法

2.1 多糖测定[6]

（1）样品溶液配制。精密称取血红栓菌子实体粉末1.00 g，用80%乙醇（料液比1∶20）在90 ℃水浴回流提取2 h，过滤，重提一次，取残渣以80%乙醇洗涤3次后，挥干；以蒸馏水（料液比1∶20）搅拌提取2 h，过滤，重提一次，残渣以蒸馏水清洗3次并过滤，合并滤液。在滤液中加入与其等体积的三氯甲烷∶正丁醇（5∶1）混合溶液，使用Sevag法除去蛋白，振荡15 min后离心10 min，重复以上操作至2%硫酸铜+10%氢氧化钠蛋白反应呈蓝色（未变色），取上清液挥发有机溶剂，并以蒸馏水定容至1 000 mL，备用。

（2）蒽酮-硫酸试液配制。精密称取0.20 g蒽酮，用100 mL的浓硫酸溶解，现配现用。

（3）标准曲线绘制。精密称取葡萄糖标准品0.10 g，用蒸馏水溶解引入100 mL的容量瓶中，定容，浓度为1.0 mg/mL，备用。

分别取葡萄糖溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，于10 mL容量瓶中定容，各取2 mL于10 mL具塞试管中，另取2 mL蒸馏水于试管中做空白对照。分别加入4 mL蒽酮-硫酸试剂，混匀，置水浴锅中煮沸10 min后，用水冷却至室温，以分光光度法测625 nm处吸光度。

（4）样品测定。取2 mL样品溶液于具塞试管中，加入4 mL的蒽酮-硫酸试剂，涡旋混匀后放入水浴锅煮沸10 min，用水冷却至室温，测625 nm处吸光度。

2.2 三萜测定[6]

（1）试剂配制。硫酸溶液的配制：取28 mL蒸馏水，按照硫酸稀释方法，加入硫酸至100 mL。香草醛溶液的制备：精密称取8 g香草醛，用甲醇溶解定容至100 mL。

（2）样品溶液配制。精密称取血红栓菌子实体粉末0.45 g，加入25 mL三氯甲烷，超声提取60 min，冷却至室温后定容至25 mL，过滤。

（3）对照品标准曲线绘制。精密称取标准品齐墩果酸10.00 mg，用三氯甲烷定容至100 mL，浓度0.1 mg/mL，为标准溶液。分别量取标准溶液0.0、0.1、0.2、0.5、0.6、0.8 mL，置于30 ℃水浴锅中挥去有机溶剂，加入5 mL硫酸溶液和0.5 mL香草醛，混匀后60 ℃水浴加热30 min，取出待其冷却，于550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。

（4）样品测定。取样品溶液1 mL于具塞试管中，将其置于30 ℃水浴锅中挥发有机溶剂7～8 min，加入0.5 mL香草醛溶液和5 mL硫酸溶液，混匀后，于60 ℃水浴加热30 min，冷却待测。

2.3 斑马鱼急性毒性检测试验[7]

试验以牛樟芝（A白、A黄、A特白）为样品对照组，血红栓菌（A特红）为样品组，同时设置斑马鱼实验标准用水为溶剂对照组。选用2-5 dpf的野生型AB品系斑马鱼为给药对象，分别按浓度梯度0.1 μg/mL，1 μg/mL，10 μg/mL，100 μg/mL，250 μg/mL，500 μg/mL，1 000 μg/mL，2 000 μg/mL及5 000 μg/mL进行水溶给药，给药方式：将子实体粉末直接溶于斑马鱼实验标准用水。每个浓度试验数量为20尾斑马鱼。

对斑马鱼模型评价样品的毒性与安全性进行检测分析，斑马鱼与人体的每千克体重的药物剂量折算系数（W）为：1/100，斑马鱼每条平均体重为0.3 g，成人按照60 kg计算，则4种样品理论上对人体的最大非致死剂量（MNLD）和半致死剂量（LD50）的计算方法为：人的剂量（mg/kg）=W×斑马鱼剂量。

3 结果与分析

3.1 多糖和三萜的含量

以质量浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），各浓度下线性关系为，①多糖：y=13.818x ‒0.0019，R2=0.9999，线性范围为10～50 μg/mL；②三萜：y=74.241x+0.0113，R2=0.9999，线性范围为1.8～12.7 μg/mL。两种成分在质量浓度范围内，线性关系良好，适用于定量分析。

根据回归方程，计算得血红栓菌中多糖含量为2.31%，三萜含量1.8%。

3.2 对斑马鱼的急性毒性浓度

4种样品药物在各浓度梯度下的具体试验结果（图1）：在0～250 μg/mL浓度范围内，斑马鱼无死亡现象；浓度为500 μg/mL，血红栓菌（A特红）样品的斑马鱼死亡率为5%，与牛樟芝A黄样品相同；浓度增至1 000 μg/mL时，A特红样品的死亡率为10%，低于牛樟芝A白和A黄；在500～2 000 μg/mL范围内，斑马鱼死亡率与样品浓度呈剂量效应。

图1 样品药物对斑马鱼死亡率的影响

根据4种样品各浓度下的斑马鱼死亡率，得出其半致死浓度（LC50）大小关系为：A特红（1 238 μg/mL）＞A白（1 237 μg/mL）＞A特白（1 046 μg/mL）＞A黄(655 μg/mL)。说明血红栓菌对斑马鱼的半致死剂量较大，安全性高。

根据斑马鱼模式的评价试验结果，血红栓菌的安全性与牛樟芝相似（表1）。A特红和A黄样品对斑马鱼的最大非致死剂量MNLD均为200 mg/kg，半数致死剂量LD50均为467 mg/kg，4组样品的斑马鱼均未观察到相应的器官毒性。推测人体对血红栓菌（A特红）的最大摄入量为2.0 mg/kg，其LD50为4.67 mg/kg，与牛樟芝A黄相等。

表1 斑马鱼模式评价样品试验结果

4 讨 论

本研究以斑马鱼模型评价血红栓菌的急性毒性，结果表明其安全性与牛樟芝相似，对斑马鱼的无作用浓度低于250 μg/mL，最大非致死剂量MNLD为200 mg/kg，半致死剂量LD50为467 mg/kg，推测其对人体的MNLD为2.0 mg/kg，LD50为4.67 mg/kg。该结果为血红栓菌的临床应用提供了数据支持。另测得血红栓菌中多糖含量为2.31%，三萜含量为1.8%，这为其有效成分的提取利用提供了依据。

当前，牛樟芝市场存在鱼目混杂的情况，由于野生资源匮乏，其价格居高不下，而血红栓菌栽培条件及成本较低，深入分析两者的药效成分和药理作用[8]，并利用现代化手段深入研究其药理机制与保健功效，或可提高血红栓菌资源利用率，部分替代牛樟芝。