8种不同炮制方法对女贞子中4种化学成分含量的影响

纪东汉， 王甫成*， 朱晓妮， 李培培， 龚道锋

(1.亳州职业技术学院 药学院，安徽 亳州 236800;2.安徽省中医药科学院 亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800)

女贞子为木犀科植物女贞(

Ligustrum

lucidum

Ait.)的干燥成熟果实,是中医临床上扶正固本的常用中药。其性味甘、苦、凉,具有滋补肝肾、明目乌发之效,用于肝肾阴虚,骨蒸潮热等症。其化学成份主要有三萜类、黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、多糖类等,其成分变化与采收时间存在有一定的关系。

女贞子临床多以炮制品入药,常见炮制方法有净制、蒸制、酒制、盐制、醋制等。关于女贞子炮制前后化学成分含量变化已有诸多报道,概括为女贞子经炮制后其中所含环烯醚萜类成分(特女贞苷、女贞苷G13、女贞苷等)含量下降,苯乙醇苷类成分(红景天苷、酪醇,羟基酪醇等)升高,但相关研究以酒制(黄酒)为主。女贞子炮制除酒制(黄酒)外,各地方炮制规范中仍有醋制、盐制、单蒸等其他制法,虽有部分文献就醋制、盐制等方面进行研究,但多为实验室设计,炮制方法与地方炮制规范有差异,针对女贞子不同地方炮制规范所制炮制品的成分变化研究较少。

目前,全国各地方中药炮制规范中关于女贞子的炮制方法有20余种,不同省市间炮制规范所制得女贞子炮制品成分含量有无较大差异,现尚不明确。为此本实验通过查阅不同省市中药炮制规范,按辅料类型和炮制工艺选取了8种代表性方法(黄酒蒸、黄酒炖、单蒸、米酒蒸、盐蒸、醋蒸、白酒炖、盐炒),采取高效液相色谱法对8种地方炮制规范炮制前后女贞子中4种成分含量进行测定,总结4种成分在炮制前后含量变化情况,为女贞子的地方炮制规范修定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 仪器 安捷伦(Agilent)1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦);AUW220D型电子分析天平(日本岛津);KQ-400E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);HH-S2型数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司);JC101型电热鼓风干燥箱(上海成顺仪器仪表有限公司)。

1.1.2 试剂 乙腈(默克股份有限公司,色谱纯);磷酸(天津市科密欧化学试剂公司,分析纯);95%乙醇(国药集团化学试剂公司,分析纯);纯净水(娃哈哈集团);女贞苷G13对照品(北京普天同创生物科技公司,批号MuST-17022211,纯度≥98.0%);红景天苷对照品(成都普菲德生物公司,批号60315,纯度≥98.0%);特女贞苷对照品(北京普天同创生物科技公司,批号MuST-16021904,纯度≥98.0%);酪醇对照品(成都普菲德生物技术有限公司,批号151028,纯度≥98.0%);黄酒(酒精度:12%,绍兴女儿红酿酒有限公司);小米香醋(绍兴市酿造有限公司);米酒(湖北爽露食品有限公司);食盐(安徽省盐业总公司);白酒(酒精度:45%,安徽古井贡酒股份有限公司),女贞子(采购于安徽省亳州市康美中药材市场,由亳州职业技术学院王甫成教授鉴定其为木犀科植物女贞

Ligustrum

lucidum

Ait.的干燥成熟果实)。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:(Aglient Zorbax SB-C18,4.60×250 mm,5 μm),流动相:乙腈(A),0.1%磷酸水(B),梯度洗脱:0～15 min,A:5%～12%;15～60 min,A:10%～33%;60～70 min,A:35%～82%;70～85 min,A:85%～95%,流速:1.0 mL/min,检测波长:224 nm,柱温:25 ℃;进样量:10 μL。

1.2.2 女贞子炮制样品制备 通过对不同省市女贞子的炮制规范的查阅发现,除河南、河北等地生品可以直接入药外,其余省份都需要炮制后才入药。其中以黄酒制(酒蒸、酒炖)最为常见,除此之外还有醋制、盐制、单蒸等方法。由于很多省市炮制规范中没有明确规定炮制时间,为保障实验顺利进行,最终由各省市炮制规范中按不同辅料及炮制工艺选取了8种炮制方法为代表进行试验。选用的8种炮制方法具体见表1。

表1 8种女贞子炮制方法Table 1 8 kinds of processing methods of Ligustrum lucidum

1.2.3 供试品溶液制备 取女贞子生品及不同炮制样品(黄酒蒸、黄酒炖、盐蒸、醋制、白酒炖、米酒蒸、盐炒、单蒸)粉碎后过三号筛,取粉末约0.5 g,精密称定。加入稀乙醇50 mL,回流提取1 h,放冷后补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液即得。

1.2.4 对照品溶液制备 分别取红景天苷、酪醇、特女贞苷、女贞苷G13对照品适量置于容量瓶中,加甲醇溶解,配成0.404 mg/mL、0.214 mg/mL、1.060 mg/mL、1.050 mg/mL的对照品储备液。精密吸取一定量已配好的对照品储备液置于容量瓶中用甲醇稀释定容,分别配制6个浓度梯度的混合对照品溶液,红景天苷浓度范围2.02～60.60 μg/mL;酪醇浓度范围1.07～32.10 μg/mL;特女贞苷浓度范围42.40～318.00 μg/mL;女贞苷G13浓度范围42.00～315.00 μg/mL。

1.2.5 线性关系考察 分别精密吸取1.2.4节混合对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,计算回归方程。

1.2.6 精密度实验 分别取低、中高3个质量浓度梯度的红景天苷(5.05、25.25、50.50 μg/mL),酪醇(2.14、10.07、25.68 μg/mL),特女贞苷(84.80、169.60、254.40 μg/mL),女贞苷G13(84.00、168.00、252.00 μg/mL)混合对照品溶液作为质控(QC)样品,每一质量浓度平行3份,分别重复进样6次,每次10 μL,根据4种成分的峰面积计算精密度。

1.2.7 稳定性实验 取女贞子生品,精密称定,按1.2.3节制备样品溶液,分别于0、2、4、8、12 h进样,每次10 μL,根据4种成分的峰面积计算相对标准偏差。

1.2.8 重复性实验 取女贞子生品,精密称定,按1.2.3节制备样品溶液6份,每份样品进样10 μL,根据4种成分的峰面积计算相对标准偏差。

1.2.9 加样回收实验 取女贞子生品6份,精密称定,精密加入对照品储备液适量,按1.2.3节制备样品,每份样品进样10 μL,根据4种成分的峰面积计算加样回收率。

1.2.10 含量测定 将女贞子生品及8种不同炮制品按1.2.3节制备成供试品溶液,进样10 μL,根据红景天苷等4种成分的峰面积计算含量。

2 结果与分析

2.1 线性关系考查

分别精密吸取混合对照品溶液各10 μL,注入液相色谱仪,记录峰面积。以对照品浓度(μg/mL)为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,计算回归方程,由表2可得4种成分的回归方程、线性范围及相关系数。

表2 4种成分回归方程、线性范围及相关系数Table 2 4 component regression equations, linear range and correlation coefficient

2.2 精密度和准确度实验

根据上述色谱条件,分别取低、中、高3个质量浓度梯度的红景天苷(5.05、25.25、50.50 μg/mL),酪醇(2.14、10.07、25.68 μg/mL),特女贞苷(84.80、169.60、254.40 μg/mL),女贞苷G13(80.00、168.00、252.00 μg/mL)混合对照品溶液(QC样品),每次进样10 μL,重复进样6次,计算精密度和准确度,准确度计算=(实测质量浓度-质控样品浓度)/质控样品浓度。由表3可得,4种成分的精密度和准确度均较好，符合要求。

表3 4种成分的精密度和准确度(n=6)Table 3 Precision and accμracy of 4 components (n=6)

2.3 重复性实验

精密称取女贞子生品粉末适量,按照上述供试品溶液制备方法1.2.3节平行制备成6份供试品溶液,分别进样测定,测得红景天苷、酪醇、特女贞苷、女贞苷G13平均含量分别为0.031 6%、0.014 3%、1.175 7%、1.141 4%,RSD分别为1.40%(

n

=6)、1.82%(

n

=6)、2.04%(

n

=6)、1.91%(

n

=6)结果表明其重复性良好

2.4 稳定性实验

取女贞子生品,按制备方法1.2.3节操作,制备成供试品溶液,分别于0、2、4、8、12 h时精密吸取10 μL进样,测得酪醇、红景天苷、女贞苷G13、特女贞苷峰面积RSD值,结果分别为1.28%(

n

=5)、1.83%(

n

=5)、2.08%(

n

=5)、1.92%(

n

=5)从所得数据看出,供试品溶液在12 h内稳定。

2.5 加样回收率

由表4可得4种成分的加样回收率,红景天苷、酪醇、特女贞苷、女贞苷G13的加样回收率分别为100.71%、101.36%、102.58%、101.26%,RSD分别为1.92%、2.47%、2.50%、2.41%。表明该方法符合女贞子的含量测定要求。

表4 女贞子中4种成分加样回收结果(n=6)Table 4 Recovery results of four components in Fructus Ligustri (n=6)

2.6 样品含量测定

由表5可得,女贞子炮制前后4种成分的含量有着一定的变化,总体为特女贞苷,女贞苷G13含量下降,红景天苷,酪醇含量上升;由图1可得,不同炮制方法间存在有一定的差异。相关色谱图见图2～3。

表5 女贞子样品含量测定结果(n=3)Table 5 Determination results of ligustrum ligμstri fruit samples (n=3)

图1 女贞子生品与不同炮制品4种成分变化柱状图Fig.1 Histogram of changes of four components of fructus Ligustri ligustri raw products and different processed products

图2 混合对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed reference substance

1.红景天苷 2.酪醇 3.特女贞苷4.女贞苷G-13

3 结论与讨论

通过对混合对照品溶液波长扫描,发现4种成分最大吸收波长各有不同,通过不同吸收波长图谱对比,选择检测波长为224 nm,试验同时考察了不同流动相(乙腈-水,乙腈-磷酸溶液,乙腈-乙酸溶液),最终确定,乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱效果较好,最终确认该条件为本研究色谱条件。

研究结果显示,不同的炮制方法对女贞子中4种成分的含量变化有着明显的影响,总体趋势为特女贞苷,女贞苷G13含量下降,红景天苷,酪醇含量上升,8种不同炮制方法中,加热时间较长的炮制方法(黄酒炖、黄酒蒸等)4种成分变化较加热时间短的的炮制方法(醋蒸、白酒炖等)变化更为明显。炮制过程中红景天苷、酪醇含量上升,特女贞苷、女贞苷G13含量下降原因可能为在水分与加热的条件下,特女贞苷、女贞苷G13发生水解反应,产生了红景天苷、酪醇单元。张学兰等、宋梦涵等的研究也已证实,女贞子中的环烯醚萜苷类如特女贞苷等,其分子上环烯醚萜部分以酯键与红景天苷或酪醇等苯乙醇苷类化合物相连,其性质不稳定,加热和水所产生的高温闷热导致酯键水解,生成红景天苷及酪醇等苯乙醇苷类物质。所以炮制后环烯醚萜苷类成分含量下降,苯乙醇苷类成分含量上升。这种变化会随加热时间的延长持续进行。鉴于2020版《中国药典》已将红景天苷作为酒女贞子质量控制成分,所以在女贞子的炮制工艺优化时,适当延长炮制时间可能会有更好的效果。盐炒女贞子酪醇含量下降,可能因为炒制时温度较高导致酪醇分解所致。

有关女贞子炮制前后成分变化的研究已有较多文献报道,但相关研究较为零散,多数为女贞子酒制(黄酒)前后成分含量变化,有些选用不同炮制方法研究炮制前后女贞子化学成分含量变化,也多为酒制(黄酒)、醋制、盐制且炮制方法多为实验室设计,与地方炮制规范存在差异。本实验选取了各省市地方炮制规范中的8种代表性方法(黄酒蒸、黄酒炖、单蒸、米酒蒸、盐蒸、醋蒸、白酒炖、盐炒),比较了8种地方炮制规范炮制后女贞子4种成分变化,为女贞子地方炮制规范研究以及科学评价女贞子饮片质量提供一定的依据,也为女贞子不同炮制品的临床应用提供参考。