肝X受体β基因多态性与2型糖尿病易感性的相关性

罗 杰，郭 蕾，陈阳希，杨 晨，朱小蔚，严妤函，万文辉，张兴虎，刘 瑜

0 引 言

2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)是遗传与环境因素相互作用导致的一种常见的代谢性疾病。各种病因导致体内胰岛素分泌不足或不能有效利用胰岛素，从而出现机体对葡萄糖不耐受引起血糖水平升高[1]。随着我国人口老龄化和生活方式的改变，T2DM的发病率逐年升高，T2DM及其相关并发症已成为影响我国居民健康的重大疾病之一。T2DM的发病机制目前尚未完全阐明，家族聚集性发病提示遗传因素参与T2DM发病[2-3]。发现与T2DM相关的基因能更好地理解T2DM的发病机制，并为治疗提供新的靶点。

肝X受体(liver X receptor, LXR)属于核受体超家族成员，本质上是配体激活的转录因子，氧化的胆固醇衍生物是其天然配体。LXR被配体激活后，需要与视黄醛X受体(retinoid X receptor，RXR)结合形成异二聚体(LXR-RXR)而具有转录活性。活化的LXR再与靶基因上特异的LXR反应元件(LXR response element，LXRE)结合，通过多种机制调节靶基因的转录[4]。人体LXR有两种亚型，LXRα和LXRβ。LXRα主要分布在肝、脾、肾、小肠、脂肪组织等，而LXRβ广泛分布于人体各组织，胰腺中主要为LXRβ[5]。已证实，LXR的很多靶基因参与了糖和脂代谢调节，与胰岛素抵抗及糖尿病发生过程密切相关[6]。因此，LXR基因是T2DM遗传学研究的候选基因，其变异可能影响T2DM的发病风险。本研究在华东汉族人群中，观察LXRβ基因上常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与T2DM易感性的关系，为进一步探讨T2DM发病机制及风险预测提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2018年1-12月在东部战区总医院门诊体检中心进行健康体检的患者510例，其中T2DM 128例(T2DM组)，对照者382例(对照组)。研究对象年龄≥18岁、汉族、籍贯均为江苏及其周边地区且相互间无生物学亲缘关系。排除既往有内分泌疾病、胰腺切除、慢性肝肾疾病及服用影响糖代谢药物者和孕妇。2型糖尿病的诊断根据既往病史(目前正在接受胰岛素或口服降糖药物治疗)和此次体检结果(符合2010年美国糖尿病协会诊断标准)。对照者均经口服葡萄糖耐量试验证实无糖代谢异常存在(包括无空腹血糖受损、糖耐量异常和糖尿病)。510例受试对象均采空腹静脉血4 mL并经乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)抗凝，-80 ℃冻存以备后续提取基因组DNA。收集受试对象社会人口学资料、既往病史等，测量腰臀比，计算体重指数(body mass index, BMI)。本研究通过原南京军区南京总医院伦理委员会的批准(批准号为：2017NZGKJ-079)，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 SNP位点的选择及基因分型根据“常见疾病-常见变异”假说[7]，选择LXRβ基因上常见的SNP位点。首先，在线Pubmed搜索LXRβ基因多态性与疾病关联研究中常选择的SNP位点；其次，查阅美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)的dbSNP数据库，找到位于基因功能区的SNP位点；最后，从HapMap数据库中选择北京汉族人群样本，以r2>0.8得到标签SNP(tag SNP)。从以上得到的SNP位点中选择在中国人群中次要等位基因频率(minor allele frequency，MAF)> 10%为本研究选择的位点(共6个)，见表1。采用TIANGENTM试剂盒提取基因组DNA并行琼脂糖凝胶电泳进行质控和定量。基因分型采用上海天昊生物科技有限公司改良的连接酶检测反应(improved ligase detection reaction，imLDR)技术。所有SNP位点的基因分型成功率均大于95%。分型结束后，随机选择10%的样品进行重复检测，一致性率为100%。

表1 肝X受体β基因单核苷酸多态性位点信息

2 结 果

2.1 一般资料比较510例研究对象中，年龄26～77岁，平均年龄(52.76±14.28)岁，其中男290例(56.86%)，女220例(43.14%)。T2DM组与对照组相比年龄较大(P=0.003)，空腹血糖水平较高(P<0.001)，具有较高的BMI和腰臀比(P<0.001)。T2DM组具有较高的高血压病、冠心病、高脂血症发病率(P均<0.01)。见表2。

表2 入组研究对象临床特征比较

2.2 LXRβ基因多态性与T2DM及体型的相关性各SNP位点在对照组中的频率分布符合哈代-温伯格平衡。校正年龄、性别、吸烟、饮酒、既往史后，非条件Logistic回归分析显示，其中rs2695121 TT基因型(OR [95%CI]= 0.48[0.25～0.85],P=0.042)和CT+TT基因型(OR [95%CI]= 0.72[0.31～0.98],P=0.038)发生T2DM的风险较CC基因型低，见表3。各基因型与BMI和腰臀比无相关性，见表4。

表3 rs2695121基因型与T2DM的相关性[n(%)]

表4 LXRβ各位点基因型与BMI和腰臀比的相关性

3 讨 论

肝X受体是糖代谢的重要调节者，它能直接感受血中葡萄糖的变化[8]。LXR激活后主要通过以下机制降低血糖：① 抑制肝糖异生酶—磷酸烯醇式丙酮酸酯羧化激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)和果糖1，6二磷酸酶(FBP1)的表达，从而抑制了糖的生成；② 上调肌肉和脂肪组织中葡萄糖转运体(主要是GLUT1和GLUT1)的表达，增加肌肉和脂肪组织对血糖的摄取；③ 增加胰腺β细胞的胰岛素分泌；④ 通过其抗炎症作用和对糖皮质激素活性的抑制(抑制肝1型11β羟基类固醇脱氢酶)提高机体对胰岛素的敏感性[9-11]。LXR是调节糖代谢的关键基因，LXRα主要与脂代谢相关，而LXRβ与糖代谢更相关。因此，本研究以LXRβ(NR1H2)为候选基因，首次在华东汉族人群中观察LXRβ基因上6个常见SNPs与T2DM和人体体型指标的相关性，在校正年龄、性别、吸烟饮酒、既往史后，发现rs2695121多态性与T2DM相关，TT/CT+TT基因型者较CC型T2DM发病风险降低，提示该位点的变异对T2DM发病有保护作用。

LXRβ基因位于染色体19q13.3上，由10个外显子组成，为相对保守基因。已有研究证实，多个LXRβ基因多态性位点与T2DM或肥胖发生发展密切相关。rs17373080(C→G)位于LXRβ基因启动子区，体外研究发现C等位基因型具有较高的转录活性[12]。Dahlman等[12]在法国人群中发现rs17373080 GG基因型对T2DM发病具有保护作用；Solaas等[13]在欧洲人群中得到了同样的结果，rs17373080(G)能够降低T2DM发病风险(保护)，但与超重、肥胖有关(促进)，这与在LXRβ基因缺陷大鼠中观察到的不同，且这些作用是似乎是矛盾的。原因是LXRβ在抑制肝糖异生、促进脂肪和肌肉组织对葡萄糖的摄取的同时，可增加肌管细胞脂肪酸的吸收和脂积累，增加三酰甘油水平。此外，SNPs可能诱导不同辅助因子的招募，从而改变LXRβ对靶基因的作用，此外还有表观遗传的影响、物种间的差异等。rs2248949(C→T)位于内含子6，Ketterer等[14]在欧洲人群中发现，T较C等位基因第一时相胰岛素分泌减少。此外，该突变还影响胰岛素原转换为胰岛素过程，T等位基因携带者的胰岛素产生量比C等位基因纯合个体减少18%。在本研究中，并未发现rs17373080和rs2248949与T2DM或BMI、腰臀比相关。rs2695121(C→T)位于内含子2，是研究报道比较多的一个位点。有关rs2695121与T2DM或肥胖的相关性，在不同的人群中得到的结果不一致： Dahlman等[15]在法国人群中发现 rs2695121(T)与肥胖相关，Rooki等[16]在伊朗人群中发现rs2695121 TT基因型发生代谢综合征的风险较CC型下降53%，Solaas等[13]在欧洲人群未发现rs2695121与T2DM、肥胖/超重有关，但rs2695121(T)空腹胰岛素水平较低。Mehrad-Majd等[17]在伊朗东北部人口中也未发现rs2695121与肥胖相关，而与血压相关。本研究发现rs2695121与T2DM发病相关，TT/CT+TT基因型者较CC型T2DM发病风险降低，提示该位点的变异对T2DM发病有保护作用，并未发现rs2695121与BMI或腰臀比相关。造成结果不一致的原因可能为种族的不同以及样本量较小等，查阅ensembl数据库rs2695121 T等位基因在中国人群中的频率(11.4%～16.7%)明显小于欧洲人(36.4%～56.6%)。rs2695121位于内含子2，它影响T2DM的机制还不清楚，有可能通过影响mRNA的剪切、稳定性或定位来影响基因的功能，或是通过与基因中其他具有生物活性的SNP连锁而表现出功能[18]。

目前，在全基因组关联研究(GWAS)中并未发现LXRβ基因多态性与T2DM或肥胖相关。由于GWAS所需的p值阈值非常低(<10-8)，而LXRβ与T2DM相关性较弱可能未报道。GWAS并没有涵盖每个基因的全部遗传变异。因此，候选基因方法仍有助于检测SNP与疾病之间的关联[19]。本研究中由于样本均来自于医院，存在选择偏倚。但病例和对照者籍贯均为江苏及其周边地区，最大程度避免了人群混杂对结果的影响。同样，由于样本量相对较少，统计效力不够，一些相关性可能发现不了，也不排除阳性位点因和其他与T2DM有关的SNPs位点连锁，而表现出与T2DM相关。研究中未对胰岛素水平和胰岛分泌功能进行检测，健康对照中可能有一部分未来会进展为T2DM患者，但即使存在对照组混入少量的病例，相关性仍然存在，该阳性结果更有价值。最后，随着dbSNP数据库和HapMap数据库不断完善，不排除该基因中还有其他位点与T2DM相关。对于本研究结果还需要更大样本量或meta分析来进一步验证。LXRβ通过对其靶基因进行调控而发挥作用，靶基因本身也存在着基因多态性，也与疾病相关，因此，对LXRβ和其靶基因联合研究更有助于理解基因变异对疾病的影响。