肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对兔皮肤冻伤的治疗作用及刺激性研究

崔亚玲，刘小虎，许子华，吴 琼

0 引 言

冻伤是指机体受到寒冷刺激而表现出的局部组织病理结构的改变，机体长时间在低温环境中，能够导致皮肤和肌肉血管极度收缩、血流缓慢、动脉搏动减弱，进而损伤神经，出现神经紊乱、意识模糊、周身疼痛，活动能力、身体协调性下降，出现共济失调的症状[1-2]。冻伤是我国的东北高寒地区或从事低温作业人员的常见急症，尤其是局部冻伤最为常见，通常在执行任务的部队中成批发生，造成非战斗减员增加，严重削弱部队战斗力。冻伤根据临床损伤程度分为Ⅳ度，Ⅰ～Ⅱ度为轻度冻伤，主要损伤皮肤、肌肉，Ⅲ～Ⅳ度为重度冻伤，主要损伤肌肉和骨[3-6]。有研究结果表明，冻结性冻伤是一种免疫复合物相关性疾病，冻伤导致大量免疫复合物生成并且沉积于局部血管壁基底膜或组织间隙，通过激活补体、血小板及其他细胞，造成沉积部位的一系列炎症性变化[7]。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏由肝素钠和肌醇烟酸酯组成，肝素钠具有抗凝作用，而肌醇烟酸酯是周围血管扩张剂，两者配伍联合用药，对提高机体冷刺激耐受力具有一定协同作用。本文对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对兔皮肤轻度冻伤的治疗作用和刺激性进行了研究，以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料日本大耳白兔，普通级，雌雄各半，体重1.5～2.0 kg，由青岛康大生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20122005。实验环境：温度20～23 ℃，湿度40%～60%，通风良好。动物实验伦理号：21000092016008。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，由北部战区总医院提供，批号：201508063，规格：每支20 g；肝素钠乳膏，由山东博士化福瑞达制药有限公司生产，批号：150624031，规格：每支20 g；赋型剂，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏基质，由北部战区总医院提供，批号：201508062，规格：每支20 g。PBY-N6 Compact全自动血液流变仪，北京普利生食品有限公司生产。CA1500全自动凝血分析仪，SYSMEX生产。XN-1000全自动模块式血液液体分析仪，SYSMEX生产。FLPI2-MOOR激光散斑成像系统，MOOR生产。MOORVMS-OXY激光多普勒血流监测系统，MOOR生产。

1.2 方法

1.2.1 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏治疗兔皮肤冻伤选取体重1.5～2.0 kg健康白兔36只，雌雄各半。按照体重排序，按随机数字表法随机分成空白对照组、模型对照组、肝素钠肌醇烟酸酯乳膏低、中、高剂量组(0.14 g/kg、0.28 g/kg、0.56 g/kg)，肝素钠乳膏组(0.14 g/kg)，共6组，每组6只，单笼饲养。

兔皮肤冻伤模型的制备：采用20%乌拉坦麻醉，除空白对照组外，其余各组白兔剪去背部两侧实验部位被毛，用纱布蘸取10%硫化钠溶液均匀涂抹于实验部位，2～3 min后待被毛溶解成糊状，立即擦去。即刻用温水彻底洗净使皮肤裸露，备用。将直径3 cm的纱布团沾满液氮(成饱和程度)，将其贴紧兔背部实验部位30 s，造成一个直径3 cm的皮肤冻伤模型[8](Ⅰ度冻伤：伤及表皮，皮肤局部红肿、充血，症状在暖和时缓慢消失，表皮脱落，水肿消退，不留瘢痕)。造模后，造模部位局部有充血、水肿和水疱形成，水疱液为浆液性或淡血性、水疱基底呈鲜红色且潮湿，皮温较高，吻合度≥90%即为造模成功。各组白兔于造模后第2天按剂量给药治疗。模型对照组涂赋型剂，每日1次；肝素钠乳膏组涂阳性对照药肝素钠乳膏，每日1次；低、中、高剂量组每日分别给药1次、2次、4次，连续给药14 d。根据《中药外用药理实验技术规范(草案)》[9]，各组在给药前以温等渗盐水清洗给药部位，后采取外用棉签点涂法给药。造模成功后第15天进行病理指标、血液指标的采样，采样前禁食12 h。每天观察并记录兔冻伤皮肤的恢复情况[10-12]。开始给药后，每天观察冻伤皮肤的触感、厚度、结痂、皱缩变形等情况并做好记录，根据局部皮肤表观情况采取等级半定量积分法计算皮损恢复愈合率。末次给药后1 h，耳缘静脉取血，检测血常规、血液生化学指标、凝血酶指标等指标。

病理学检查：用10%甲醛溶液对冻伤部位组织进行固定，石蜡包埋，切片，HE染色，于光学显微镜下进行病理观察和病理评分。病理评分标准：(1)炎细胞浸润程度：①皮下基本正常，记为(-)，记0分；②皮下轻度充血水肿，少量炎性细胞浸润，记为(+)，记1分；③皮下中度充血水肿，较多炎性细胞浸润，记为(++)，记2分；④皮下重度充血水肿，大量炎性细胞浸润或有脓肿形成，记为(+++)，记3分。(2)溃疡程度：①无溃疡，记为(-)，记0分；②出现一个溃疡，溃疡面积相对较小，记为(+)，记1分；③出现一个溃疡，溃疡面积相对较大，记为(++)，记2分；④出现两个以上溃疡，记为(+++)，记3分。(3)肉芽组织形成：①无肉芽组织形成，记为(-)，记0分；②肉芽组织面积相对较小，记为(+)，记1分；③肉芽组织面积相对适中，记为(++)，记2分；④肉芽组织面积相对较大，记为(+++)，记3分。

1.2.2 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对兔皮肤刺激性试验研究取白兔24只，雌雄各半，实验前将兔适应性饲养1周，按照体重排序，按随机数字表法分成正常皮肤肝素钠肌醇烟酸酯乳膏低(0.07 g/kg)、中(0.14 g/kg)、高(0.28 g/kg)剂量组和破损皮肤乳膏低(0.07 g/kg)、中(0.14 g/kg)、高(0.28 g/kg)剂量组，共6组，每组4只，雌雄各半。采用赋形剂作对照，同体左右侧自身对比法。试验前24 h对给药区(背部)进行脱毛处理(范围左、右各3 cm×3 cm)，如皮肤有损伤则不宜进行试验。进行破损皮肤试验时，涂药部位用针头划井字，皮肤破损程度以损伤表皮层为限，左右两侧皮肤的破损程度应基本一致[13]。各组动物均在左侧去毛的皮肤上涂抹相应剂量的受试药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏，右侧涂抹赋形剂做对照。保持药物停留时间4 h。涂药结束后用等渗盐水清洁给药部位。每次给药时间相同，连续在同一部位涂药7 d。每天去除药物后1 h以及次日涂抹前观察及记录红斑及水肿程度，并按皮肤刺激反应评分标准打分[13]。同时观察涂抹部位是否有色素沉着、出血点、皮肤粗糙等情况及其发生时间及消退时间。末次涂抹后，在去除药物后24 h、48 h、72 h肉眼观察并记录涂抹部位有无红斑和水肿等情况。计算每一观察时间点各组积分均值，计算观察期限内每天每只动物刺激积分均值，按皮肤刺激强度评价标准[13]对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏进行刺激性评价。

2 结 果

2.1 兔冻伤皮肤外观冻伤造模后观察发现皮肤发白，随后慢慢变红。1 d 后观察冻伤面出现颜色发红、水肿。4～9 d 后模型对照组颜色无明显变化，部分水肿情况加重，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏各给药组及肝素钠乳膏组冻伤面颜色开始变浅，水肿情况改善，创面结痂，开始出现毛发生长现象。14 d 后，肝素钠乳膏组颜色有所改善，轻微水肿，而肝素钠肌醇烟酸酯乳膏各给药组颜色趋于正常，结痂逐渐愈合，毛发生长趋于正常。见图1。

图1 各组冻伤造模兔冻伤皮肤的恢复情况

对皮损恢复愈合率结果进行分析，伤后第7天，低、中、高剂量组和肝素钠乳膏组皮肤愈合率分别为(35.83±2.08)%、(44.58±8.27)%、(38.42±6.76)%、(32.96±4.00)%。对伤后第14天结果观察，低、中、高剂量组和肝素钠乳膏组皮肤愈合率分别为(67.45±8.73)%、(65.65±8.18)%、(81.66±3.66)%、(60.05±12.16)%。造模7 d后，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中剂量组和肝素钠乳膏组皮肤损愈合率与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；造模14 d后，各给药组的愈合率与模型对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。说明肝素钠肌醇烟酸酯乳膏有较强的促进轻度冻伤兔皮肤创面愈合作用，加速兔皮肤轻度冻伤的治愈。见图2。

与模型对照组比较，*P<0.05、**P<0.01图2 各组兔皮肤愈合率结果

2.2 血液学指标的检测与分析肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型血常规的结果表明，模型对照组与空白对照组比较，白细胞计数、淋巴细胞比率、中性粒细胞比率有明显改变(P<0.01)；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中剂量组单核细胞比率与模型对照组比较有较明显改变(P<0.05)；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏高剂量组与模型对照组比较嗜酸性粒细胞比率有明显改变(P<0.01)。见表1。

表1 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型血常规的影响

肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型血液生化学指标的结果表明，模型对照组与空白对照组比较，血液生化指标全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切、红细胞压积、红细胞聚集指数有明显改变(P<0.01)；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏中剂量和高剂量组与模型对照组比较，可使红细胞压积和红细胞聚集指数明显升高(P<0.01)。见表2。

表2 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型血液生化学指标的影响

肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型凝血酶指标的结果表明，造模14 d后，模型对照组与空白对照组比较，凝血酶时间有较明显升高(P<0.05)；凝血酶原时间和纤维蛋白原与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；其余各剂量组与模型对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型凝血酶指标的影响

2.3 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型病理指标的影响造模14 d后，模型对照组与空白对照组比较，炎细胞浸润程度和肉芽组织面积有明显改变(P<0.01)，溃疡程度有较明显改变(P<0.05)，说明造模成功。肝素钠低剂量组溃疡程度与模型对照组比较有较明显改变(P<0.05)，肉芽组织面积与模型对照组比较有明显改变(P<0.01)；肝素钠中剂量组炎细胞浸润程度与模型对照组比较有明显改变(P<0.01)，溃疡程度与模型对照组比较有较明显改变(P<0.05)。见表4。

表4 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔实验性冻伤模型病理指标的影响

2.4 皮肤刺激性试验结果兔正常皮肤的刺激性试验结果显示，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏低、中、高剂量及赋形剂多次给药对白兔正常皮肤各时间点均未见局部红斑、水肿、色素沉着、出血点及皮肤粗糙等情况，表明肝素钠肌醇烟酸酯乳膏及赋形剂对白兔正常皮肤无刺激作用(0分)。兔破损皮肤的刺激性试验结果显示，肝素钠肌醇烟酸酯乳膏高剂量多次给药对白兔破损皮肤，在给药第3天起出现红斑现象，末次涂药72 h后逐渐恢复，评分结果说明高剂量肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对白兔破损皮肤有轻度刺激作用(0～2.75分)，而肝素钠肌醇烟酸酯乳膏低剂量、中剂量及赋形剂均未发现对白兔破损皮肤有刺激作用(0～0.25分)。由此可知，低、中、高剂量肝素钠肌醇烟酸酯乳膏多次给药对于白兔正常皮肤无刺激性作用，而对于白兔破损皮肤，高剂量(0.28 g/kg)有轻度刺激作用。见表5。

表5 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏高剂量给药后白兔皮肤刺激反应评分(n=4)

3 讨 论

冻伤是机体的一部分组织因寒冷侵袭而出现局部损伤的症候群。部分组织出现血液循环障碍，造成皮肤和肌组织的充血、水肿、坏死甚至形成坏疽，从而发生比较严重的局部或全身损伤[14]。冻伤分为四个等级：Ⅰ度冻伤伤及表皮，皮肤局部红肿、充血，症状在暖和时缓慢消失，表皮脱落，水肿消退，不留瘢痕。Ⅱ度冻伤伤及真皮，皮肤局部明显充血、水肿，12～24 h内形成水疱，疱液呈血清样，水疱在2～3周内干燥结疤，以后脱痂愈合，可有轻度瘢痕形成。Ⅲ～Ⅳ度为重度冻伤，主要损伤全层皮肤、皮下组织、肌肉和骨骼[15]。冻伤初期血小板数增加，聚集率增高，局部组织出现短时充血，红肿，血流加速[16]。

肝素钠能干扰血凝过程中的许多环节，阻止血小板凝集和破坏，妨碍凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原变为凝血酶；抑制凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白。肌醇烟酸酯，是一种温和的周围血管扩张剂，解除血管痉挛，改善末稍血管循环，可选择性地使寒冷刺激的病变部位和敏感部位的血管扩张。肝素钠和肌醇烟酸酯配伍联合用药能够使白兔冻伤面皮肤颜色趋于正常，毛发生长趋于正常，结痂逐渐愈合，大大提高皮肤愈合率，亦能明显减轻白兔实验性冻伤模型的溃疡程度、肉芽组织面积和炎细胞浸润程度。因冻伤的组织血流不畅，肝素钠长期或过量使用会导致皮肤过敏、系统性凝血功能降低，反而容易形成血肿、血栓，这可能是抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)局部耗竭所致，两药合用，肌醇烟酸酯改善末梢血管循环机制，不但增效，还能因血管扩张缓解长期单纯使用肝素钠易导致的局部血肿血栓形成和皮肤刺激，有效降低系统性凝血功能低下的副作用，两者合用具有相辅相成的效果，但对于白兔破损皮肤，高剂量(0.28 g/kg)用药有轻度的刺激作用，故用药时应酌情控制用量。