模拟消化对乳清肽结构和抗氧化活性的影响

冯晓文，赵晓涵，程青丽，潘骁琪，刘文颖*

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司北京市蛋白功能肽技术研究中心，北京 100015；2.北京城市学院生物医药学部，北京 100094）

乳清蛋白是利用现代先进工艺从牛奶中分离提取出来的一类蛋白质，主要成分为β-乳球蛋白（βlactoglobulin，β-LG）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、免疫球蛋白、血清蛋白、乳铁蛋白等，其中免疫球蛋白具有抗氧化、提高免疫力的作用[1]。此外，乳清蛋白中还含有丰富的半胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸，能很好地维持体内谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平，发挥抗氧化作用[2]。

乳清肽是以乳清蛋白为原料经酶解工艺制得，与乳清蛋白相比，具有更好的起泡性、乳化性，且更易被机体吸收、转运和利用[3]。已有研究表明，乳清蛋白经消化吸收后，产生的部分蛋白质片段和肽类也具有生物活性和功能[2]，例如抗氧化活性、调节血糖功能及血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性等[1，3-4]，而关于体外模拟消化对乳清肽结构和抗氧化活性的影响鲜有研究和报道。基于此，本研究以乳清肽为研究对象，通过体外模拟胃肠道消化，以分子质量分布、紫外全波长扫描、圆二色光谱（circular dichroism，CD）揭示消化前后乳清肽结构的变化；以DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）4个抗氧化指标结果揭示消化前后乳清肽抗氧化活性的变化。以期为乳清肽在食品方面的多元化开发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳清粉：北京中食海氏生物技术有限公司；碱性蛋白酶（20 000 U/g）、中性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶（3 000 U/g）：诺维信生物技术有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、过硫酸钾、醋酸钠：北京化学试剂公司；胰蛋白酶（74 000 U/g）：南宁庞博生物有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1-1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二盐酸盐[2，2′-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH]、荧光素钠、水溶性维生素 E（Trolox）：美国 Sigma公司；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：南京森贝伽生物科技有限公司；2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪 [2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：酷尔化学科技（北京）有限公司；三氯化铁、硫酸亚铁：西陇化工股份有限公司。以上化学试剂均为分析纯。

YG30型喷雾干燥机：无锡市阳光干燥设备厂；HH-4数显恒温水浴锅：普瑞斯机械有限公司；FE20K型pH计：瑞士梅特勒-托利多公司；KQ-250E超声波振荡器：昆山市超声仪器有限公司；J-810圆二色光谱仪：美国Jasco公司；Spectra MR多功能酶标仪：美国Dynex公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪：美国MD公司；LC-20AD型高效液相色谱仪：日本岛津公司；UV-1780紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清肽的制备

乳清肽经两步酶解法制得。精确称取50 g乳清粉于1 000 mL蒸馏水中，混匀，90℃加热10 min，降温至55℃，使用pH计调节溶液的pH值为8.5，然后加入碱性蛋白酶0.40 g，酶解3 h；调节溶液的pH值为7，温度为45℃，加入中性蛋白酶0.45 g，酶解2 h。酶解完毕，高温灭酶15 min。冷却至27℃，10 000 r/min离心30 min，弃沉淀。用截留分子质量为1 000 Da的超滤膜超滤上清液，得分子质量小于1 000 Da的滤过液，然后在进料温度25℃、进料速度14 mL/min、进风口温度135℃、进风压力20 kPa条件下进行喷雾干燥，得到乳清肽干粉[3]。

1.2.2 体外模拟胃肠道消化试验

1.2.2.1 胃蛋白酶消化试验

配制质量浓度为50 mg/mL的乳清肽溶液100 mL，取20 mL 1 mol/L的HCl溶液调节pH值为2，于37℃水浴锅中加热2 min，加入3%（质量分数）胃蛋白酶（≥250 U/mg），混匀，37℃下边搅拌边消化3 h，然后100℃灭酶10 min，待样品冷却至27℃后，进行后续试验，此为模拟胃液组。另取消化前样品作为对照组[5]。

1.2.2.2 胰蛋白酶消化试验

取1.2.2.1配制的乳清肽溶液20 mL于离心管中，使用pH计调节pH值为6.8，37℃水浴加热1 min，加入3%胰蛋白酶（≥250 U/mg），混匀。37℃水浴锅中边搅拌边消化3 h，100℃灭酶10 min。冷却至27℃后，进行后续试验，此为模拟胰液组[5]。

1.2.2.3 先胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化试验

按1.2.2.1步骤进行胃蛋白酶消化后，调节pH值为6.8，37℃水浴加热1 min，加入3%胰蛋白酶（≥250 U/mg），混匀，于37℃水浴中边搅拌边消化3 h，100℃灭酶10 min。待冷却至27℃后，进行后续试验，此为先胃后胰组[5]。

1.2.3 分子质量分布测定

分子质量分布采用高效凝胶过滤色谱法测定。色谱条件为色谱柱：TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm；流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（体积比）；流速：0.5 mL/min；进样体积：10 μL；检测波长：220 nm；柱温：30℃；紫外检测器检测。使用1 mg/mL的样品溶液进行测定，样品溶液经流动相配制，然后经孔径0.2 μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，数据使用GPC软件处理。以乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子质量189 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子质量451 Da）、杆菌酶（分子质量1 450 Da）、细胞色素C（分子质量12 500 Da）为肽标准品，配制质量分数0.1%溶液，过膜后进样，绘制相对分子质量校正曲线[6]。

1.2.4 紫外全波长扫描

将所测溶液的质量浓度稀释为2.0 mg/mL，移取部分于石英比色皿中，利用紫外可见分光光度计进行紫外全波长扫描，扫描条件为扫描波长245 nm～325 nm；狭缝宽度1.0 mm；采样间隔0.5 nm；慢速扫描。

1.2.5 圆二色光谱扫描

配制质量浓度1.0 mg/mL的样品溶液，移取部分于石英比色皿中，使用圆二色光谱仪测定其二级结构组成，圆二色光谱条件：光源采用氙灯；氮气输出压力为0.4MPa；带宽1.0nm；光谱测量范围180 nm～260 nm；步进0.5 nm；数据点采样时间0.25 s。对蛋白样品进行圆二色光谱采集，每个样品采集3次，用CDNN 2.1-Simple Spectra软件分析样品圆二色光谱图，从而得出溶液中二级结构的组成与含量。

1.2.6 DPPH自由基清除能力测定

将不同处理组的样品溶液用超纯水分别稀释为1.0、2.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL，向 0.1 mL 的样品溶液中加入0.1 mL的无水乙醇溶液，此为空白组；向0.1 mL的样品溶液中加入0.1 mL的DPPH-无水乙醇溶液，此为样品组；向0.1 mL的蒸馏水中加入0.1 mL的DPPH-无水乙醇溶液，此为对照组。每组样品做3组重复，摇床晃动96孔板使反应体系混匀，25℃避光反应30min，然后于517 nm处测定吸光值，DPPH自由基清除率根据式（1）进行计算[7-9]。

式中：AX为样品组吸光值；A0为空白组吸光值；A1为对照组吸光值。

1.2.7 ABTS＋自由基清除能力测定

参照Rezanejad等[10-11]的方法，并略作修改。将ABTS＋自由基储备液和过硫酸钾溶液等体积混合，25℃过夜便得ABTS工作母液。稀释ABTS工作母液后得ABTS工作液。向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL不同浓度的Trolox标准溶液，此为标准组；向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL的1 mg/mL样品溶液，此为样品组；向0.2 mL ABTS工作液中加入10 μL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS），此为空白组。每组试验做3组平行，晃匀反应液。25℃避光反应5 min，734 nm处测定OD值。以不同浓度的Trolox标准溶液OD值为纵坐标，Trolox浓度为横坐标制得标准曲线，根据标准曲线可得样品的ABTS＋自由基清除能力，单位以mmol Trolox/g表示。

1.2.8 FRAP值测定

根据Amjadi等[12-13]的方法测定样品的还原能力，并稍作修改。将醋酸钠缓冲液、TPTZ溶液和FeCl3溶液按一定比例混合得FRAP工作液。37℃条件下，向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的PBS，此为空白组；向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的不同浓度的FeSO4标准溶液，此为标准样品组；向0.18 mL的FRAP工作液中加入5 μL的1 mg/mL的样品溶液，此为样品组。每组做3个平行，晃匀96孔板。37℃下反应5 min，于593 nm处测定各孔OD值，由FeSO4标准溶液及对应的OD值绘制标准曲线，并计算样品的铁离子还原能力，单位以μmol FeSO4/g表示。

1.2.9 ORAC值测定

取96孔板，于标准溶液孔中加入25 μL不同浓度梯度的Trolox标准溶液，空白孔和对照孔中分别加入25 μL 75 mmol/L PBS，样品孔加入 25 μL 的 1 mg/mL的样品，每组重复3次。各孔在避光条件下迅速加入100 μL 0.8 μmol/L的荧光指示剂，混匀，96孔板作遮光处理，37℃反应20 min。反应完毕，空白孔中加入75 μL的 PBS，其余各孔迅速加入 75 μL 150 mmol/L AAPH溶液。在激发波长485 nm和发射波长530 nm下测定各组样品的吸光值。通过处理标准品的吸光值得到不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线，然后计算样品的ORAC值，结果表示为μmol Trolox/g[14-15]。

据知情人回忆，黎永兰的教学成绩优异，她所带班级在广安名列前茅。2003年，黎永兰参加了公务员考试，告别讲台成为一名公务员，先后在广安大有乡、龙台镇等地担任了副乡长、镇长等职务，“工作很有一套”。

1.3 数据处理

每组数据平行测定3次，结果用平均值±标准差表示，使用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 消化前后乳清肽的分子质量分布

乳清肽经体外模拟胃肠道消化后的分子质量分布结果见表1。

表1 不同处理的乳清肽的分子质量分布Table 1 Molecular weight distributions of whey peptides with different treatments

由表1可知，不同处理组中，分子质量范围在150 Da～1000Da的组分所占比例最大，均高于80%。与未消化组相比，先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后3000Da～5 000 Da的组分减少了97.44%，推测其原因可能是这一范围的肽链含有较多的胃蛋白酶识别位点。经过胃蛋白酶、胰蛋白酶、先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后，分子质量范围在150 Da～1 000 Da的组分含量均有所增加，重均分子质量下降，但下降幅度不超过16.26%。推测其原因可能是胰蛋白酶将大分子质量的多肽或蛋白质水解成分子质量较小的短肽及氨基酸。张韦唯[16]同样通过体外模拟胃肠液消化处理发酵菜粕抗氧化肽，其中分子质量小于1 000 Da的组分在消化后有所增加，与乳清肽变化规律一致。Zhang等[17]通过模拟胃肠液消化得到的大豆蛋白水解物，其小于1 000 Da的组分较消化前相比有所增加，与本试验变化趋势一致。

2.2 消化前后乳清肽的紫外全波长扫描

消化前后乳清肽的紫外全波长扫描结果见图1。

图1 不同处理的乳清肽的紫外全波长扫描Fig.1 Ultraviolet full wavelength scanning of whey peptides with different treatments

如图1所示，4组样品在280 nm附近均有一个不明显的吸收峰，且在经模拟胃肠液消化处理后，较未消化组相比，模拟胃液组和模拟胰液组乳清肽在280 nm处的吸光值升高。280 nm附近OD值的变化与色氨酸和酪氨酸的芳香杂环π-π*跃迁相关，消化后乳清肽溶液的紫外吸收峰值升高，则表明乳清肽在消化后，溶液中色氨酸和酪氨酸残基的芳香杂环的π-π*跃迁发生了变化，从而使得紫外吸收峰值发生了变化[18]。

2.3 消化前后乳清肽的圆二色光谱扫描

消化前后乳清肽的圆二色光谱扫描结果见图2。

图2 不同处理的乳清肽的圆二色光谱图Fig.2 Circular dichroism spectrogram of whey peptides with different treatments

用CDNN 2.1-Simple Spectra软件对所得的CD图进行分析，得到相应的二级结构组成，如表2所示。分析表2可得，乳清肽在模拟胃肠液消化处理以后，α-螺旋较未消化组相比有所增加，最大增加比例为15.48%；β-折叠在模拟胃肠液消化处理后较未消化组相比所占比例有所降低，最大降幅为31.88%；β-转角、无规则卷曲消化前后变化不明显。可得，乳清肽的二级结构组成对胃蛋白酶和胰蛋白酶消化均有很好的稳定性。乳清肽中α-螺旋含量少，而无规则卷曲的含量多，则其无序性较高且结构比较松散[19-20]。

表2 不同处理的乳清肽的二级结构Table 2 Secondary structures of whey peptides with different treatments

2.4 消化前后乳清肽的DPPH自由基清除能力

消化前后乳清肽的DPPH自由基清除能力结果见图3。

图3 不同处理的乳清肽的DPPH自由基清除活性Fig.3 DPPH free radical scavenging activities of whey peptides with different treatments

如图3所示，乳清肽的DPPH自由基清除能力在经模拟胃液消化前后未发生明显改变，表明乳清肽的DPPH自由基清除能力具有很强的抗胃蛋白酶消化稳定性；但是，模拟胰液组及先胃后胰组较未消化组相比，其DPPH自由基清除能力大幅度降低，在浓度10mg/mL时，未消化组DPPH自由基清除率为91%，而先胃后胰组在同浓度下DPPH自由基清除率为33%，原因可能是胰蛋白酶将具有DPPH自由基清除能力的活性肽段水解为更小的肽段或者氨基酸，从而使得消化后DPPH自由基清除能力极大降低。Yang等[9]研究了不同浓度的酱油糟蛋白水解物的DPPH自由基清除能力，结果表明酱油糟蛋白水解物的DPPH自由基清除率均呈剂量依赖性，与本试验变化规律一致。李茹等[19]的研究表明新鲜萝卜苗酶解后DPPH自由基清除率有所降低，与本试验乳清肽经模拟胰液消化后的变化相似。

2.5 消化前后乳清肽的ABTS＋自由基清除能力

消化前后乳清肽的ABTS＋自由基清除能力结果见图4。

图4 不同处理的乳清肽的ABTS+自由基清除能力Fig.4 ABTS+free radical scavenging capacity of whey peptides treated with different treatments

如图4所示，经模拟胃肠液消化以后，乳清肽的ABTS＋自由基清除能力都有一定程度的提高（p＞0.05）。造成这一现象的可能原因是经模拟胃肠液消化以后，乳清肽中部分大分子质量肽段被水解为具有ABTS＋自由基清除活性的小肽段，增强了乳清肽的ABTS＋自由基清除能力。毛小雨[21]研究得到芸豆蛋白在经模拟胃肠消化后其消化产物的ABTS＋自由基清除能力较消化前均有所提高，与本试验研究结果一致。

2.6 消化前后乳清肽的铁离子还原能力

消化前后乳清肽的铁离子还原能力结果见表3。

表3 不同处理的乳清肽的FRAP值Table 3 FRAP values of whey peptides treated with different treatments

由表3可知，乳清肽经模拟胃肠液消化以后，其FRAP值都得到了不同程度的提升，这与其ABTS＋自由基清除能力变化趋势一致，结合分子质量分布结果可知，经模拟胃肠液消化以后乳清肽中分子质量150 Da～1 000 Da的组分均有所增加。研究表明，与高分子质量肽相比，低分子质量肽具有更好的还原能力，从而使得消化后乳清肽FRAP值有所增加[22]。张文敏等[23]通过酶解制备亚麻籽粕的酶解物也有相同的发现，即分子质量较低的亚麻籽粕肽具有较高的FRAP值。

2.7 消化前后乳清肽的氧自由基吸收能力

消化前后乳清肽的氧自由基吸收能力结果见图5。

图5 不同处理的乳清肽的ORAC值Fig.5 ORAC values of whey peptides treated with different treatments

如图5所示，与未消化组相比，模拟胃液组的ORAC值显著提高（p＜0.05），模拟胰液组的ORAC值极显著提高（p＜0.01）。CHO[24]研究了米糠蛋白分离物在模拟胃肠消化过程中抗氧化性能的变化，其中ORAC值在模拟胃肠消化后得到了显著提高，与本试验乳清肽ORAC值的变化规律一致。造成这种现象的原因可能是酶解使得具有抗氧化活性的氨基酸或短肽暴露出来，具有抗氧化活性的物质有效地阻止了自由基连锁反应，从而使得酶解后乳清肽ORAC值极大提高[25]。

3 结论

本研究以乳清蛋白为原料，在前期酶解工艺的基础上制备得到了乳清肽。通过使用高效凝胶过滤色谱法，测定经模拟胃肠液消化以后乳清肽的分子质量分布变化，结果表明乳清肽在消化后分子质量范围在150 Da～1 000 Da的组分含量均有所增加，重均分子质量下降，但下降辐度不超过16.26%；经紫外全波长扫描后，4组乳清肽溶液中280 nm处均有一个不明显的吸收峰，且模拟胃液组和模拟胰液组的乳清肽吸收峰高于未消化组，其可能的原因是乳清肽经模拟胃肠液消化以后色氨酸与酪氨酸的芳香杂环组成发生了变化；圆二色光谱结果表明了乳清肽中α-螺旋在经模拟胃肠液消化后虽有所增加，但总量较少，而无规则卷曲占所有二级结构总量的约1/3，表征了乳清肽的结构无序性高且比较松散。ABTS＋自由基清除率、FRAP值及ORAC值经模拟胃肠液消化以后，均有所升高，ORAC值经模拟胃肠液消化以后提高显著；DPPH自由基清除率经模拟胰液消化后有所降低，从40%～80%范围降到了20%～30%，但仍具备一定的DPPH自由基清除活性。综上，乳清肽在结构和抗氧化活性方面均具有一定的抗消化稳定性，且整体上抗氧化活性在消化后有所增强，这为乳清肽在抗氧化食品及相关食品添加剂的应用方面提供了一定的理论基础。