天然冬虫夏草不同组分对小鼠肠道损伤修复的作用机制

方秋月，王君巧，谌淑平，董 楠，聂少平

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

冬虫夏草，又名夏草冬虫、虫草，是指麦角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1]，在我国主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肃等省3 000～5 200 m的高海拔地区[2]。冬虫夏草味甘，性温，归肺、肾经，具有补肾益肺、止血化痰等功效，主要包含糖类、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、无机元素、维生素等化学成分[3-4]，现代药理学研究显示，冬虫夏草具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、增强机体免疫力等作用[5]。

在本课题组前期的研究中，对天然冬虫夏草的化学成分和多糖结构进行了系统的研究[6-8]。此外，天然冬虫夏草多糖在体外表现出较强的免疫调节作用[9]，并在体内显著降低环磷酰胺诱导的肠道损伤，发挥肠粘膜免疫调节作用[10]。然而，其他提取物的生物活性尚不清楚，对肠道损伤的改善作用也不明确，因此，本研究收集天然虫草多糖提取过程中各个组分，建立环磷酰胺诱导的免疫抑制模型，研究不同组分对小鼠肠道损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然冬虫夏草取材于中国青海省，环磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)购于美国Sigma公司，香菇多糖购于上海江莱生物，小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3) ELISA试剂盒购于南京森贝伽公司，小鼠分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)试剂盒购于武汉碧云天公司。

雌性BALB/c小鼠，6周龄，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司(资格证号：SCXK (湘) 2016-0002)，实验动物符合美国国家健康研究院规定(NIH Publication 85-23,1996)，实验操作经南昌大学动物保护评审委员会批准。

1.2 仪器与设备

3K15低温高速离心机，美国Sigma公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；-80 ℃超低温冰箱、E-330型多功能酶标仪，美国Thermo公司；SHP-50生化恒温培养箱，上海森信仪器有限公司；CKX41倒置荧光显微镜，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 天然冬虫夏草不同组分的提取

采用水和乙醇分别提取天然冬虫夏草不同组分，过程如下，用80%乙醇浸泡冬虫夏草原料过夜，离心得到上清醇提物(EE)及沉淀醇提残渣(REE)。REE用热水浸提3次，离心得上清水提物(WE)和水提残渣(RWE)。WE用无水乙醇沉淀过夜，离心后沉淀为粗多糖(NCSP)，上清为醇溶物(WE-S)。NCSP用 Sevag 试剂除去游离蛋白后再用无水乙醇沉淀得到纯多糖(NCSP-50)，具体方法参考实验室前期研究[9]。

1.3.2 动物分组及处理

清洁级雌性BALB/c小鼠130只，6～8周，(20.0±2.0) g，(22±1) ℃环境适应性饲养7 d后，取118只小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg·kg-1bw，连续注射3 d，建立免疫抑制模型，未造模的12只为正常对照组(NC)。造模结束后随机选取10只小鼠检测相关指标确定造模成功。剩下造模了的108只小鼠随机分为9组，分别为：原料粉末组(NCS)、醇提物组(EE)、醇提残渣组(REE)、水提物组(WE)、粗多糖组(NCSP)、醇溶物组(WE-S)、纯多糖组(NCSP-50)、香菇多糖阳性对照组(LNT)以及模型对照组(MC)。第11～17 d，10组小鼠进行灌胃，灌胃情况如下：REE、WE、NCSP和NCSP-50组等含有一定多糖含量的组分，以实验室前期研究为参照，剂量为100 mg·kg-1·bw[10]；其他组分(NCS、EE、WE-S)以粗多糖NCSP的剂量为基础，依据相对于原料的得率[11]确定剂量如下：NCS组(1330 mg·kg-1·bw)，EE 组(394 mg·kg-1·bw)，WE-S 组(58 mg·kg-1·bw)；LNT组为100 mg·kg-1·bw；其中EE、WE、NCSP、WE-S、NCSP-50等5个组分可溶于水，称取灌胃所需剂量后直接溶于生理盐水配制成溶液；NCS和REE经反复粉碎后称取给药所需剂量后用生理盐水配制成低浓度悬浮液，分多次灌胃给药，NC组和MC组分别灌胃等体积生理盐水。末次给药24 h后称重，颈椎脱臼处死小鼠，收集胸腺、脾脏、小肠等脏器，保存于-80 ℃。

此外，实验前期也对水提残渣RWE进行了研究，但是实验过程中RWE组小鼠全部死亡。经解剖后，发现该组小鼠胃里堆积未消化残渣，推测可能是由于RWE难以被消化，因此，后期实验未对RWE进行研究。

1.3.3 小鼠器官指数的测定

小鼠进行颈椎脱臼处死后，取出胸腺和脾脏，用生理盐水漂洗后用滤纸吸干多余水分，称重，以胸腺或脾脏(mg)和体重(g)的比值表示胸腺和脾脏的指数。

1.3.4 小鼠小肠紧密连接蛋白的观察

小鼠解剖后，用剪刀剪取3 cm小鼠空肠浸于4%多聚甲醛中进行固定，参考刘丹凤[12]等的方法进行脱水固定及腊片包埋，参考Poritz[13]等的方法，采用直接免疫荧光法检测小肠紧密连接蛋白表达，处理好的组织切片，200倍荧光显微镜下观察紧密连接蛋白表达并拍照。

1.3.5 小鼠小肠IgA分泌细胞数量以及sIgA含量的测定

采用直接免疫荧光法检测定小肠IgA分泌细胞的数量，方法同1.3.4，处理好的组织切片，200倍荧光显微镜下选取4个视野观察并拍照，运用Image-Pro Plus 6.0计数分泌IgA阳性细胞数，并取4个视野下IgA分泌细胞数量的总值。

取适量小肠组织用冷生理盐水制成10%组织匀浆，3000 r·min-1离心15 min，收集上清液并分装保存于-80 ℃备用，参考说明书测定小肠sIgA含量。

1.3.6 小鼠小肠细胞因子的测定

取1.3.5收集的小肠上清液，参考说明书测定小肠IL-17和TGF-β3含量。

1.3.7 小鼠小肠转录因子的测定

取适量小肠组织，采用定量即时聚合酶链锁反应(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)测定转录因子的表达。根据Trizol说明书提取总RNA，以提取的总 RNA为模板，用cDNA反转录试剂盒进行逆转录反应，RT-qPCR扩增参照试剂盒说明，以管家基因β-actin作为内参，mRNA 的结果采用相对定量法，所有要检测的细胞因子的基因均用Ct值来表示，用2-ΔΔCt来计算每个处理组基因的相对表达。目的基因引物序列及退火温度如表1。

表1 目的基因引物序列及退火温度

1.4 统计学分析

2 结果与分析

2.1 天然冬虫夏草不同组分对小鼠器官指数影响

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，胸腺是T细胞分化成熟的场所，能调节多种免疫细胞的分泌表达[14]，脾脏是机体进行特异性免疫调节的主要场所，能够产生多种免疫应答[15]。如表2所示，与正常组相比，模型组小鼠胸腺严重萎缩，灌胃不同组分后，除NCS组外其它各组的胸腺指数均有回升；环磷酰胺能通过代偿性增生导致脾脏肿大，因此造模后的脾脏指数与正常组相比显著提高(P<0.01)，除NCS和REE组外，其它各组的脾脏指数均有显著下降，且EE组效果最为显著。表明天然冬虫夏草各提取物组分能通过调节免疫器官指数来缓解环磷酰胺造成的免疫器官损伤。

表2 天然虫草不同组分对器官指数的影响

2.2 天然冬虫夏草不同组分对小鼠小肠组织结构形态及紧密连接蛋白的影响

小肠是各种营养物质最终消化吸收的主要器官，保持正常肠道屏障功能对小肠发挥生理功能具有重要意义[16]。肠道紧密连接蛋白是肠道机械屏障的重要组成部分，由跨膜蛋白(Claudin、Occludin等)和细胞内蛋白(ZO等)之间的相互作用组成，能够阻止过敏原，毒素和病原体等大分子的扩散[17-18]。如图1所示，与正常组相比，模型组的紧密连接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)的表达量明显降低且不连续，与模型组相比，其它各组均能提高紧密连接单边的表达量且表达相对较连续，可以看出天然冬虫夏草不同组分可以在一定程度上提高紧密连接表达，从而修复肠道机械屏障。

注：A 、B、C分别为小肠紧密连接蛋白Claudin-1，Occludin，ZO-1。

2.3 天然冬虫夏草不同组分对小鼠小肠sIgA含量以及IgA分泌细胞数目的影响

B细胞在受到抗原刺激后进入黏膜固有层形成IgA分泌细胞[19]，成熟的IgA分泌细胞可进一步分化成为sIgA，作为黏膜层中最丰富的免疫球蛋白，sIgA具有抵御病原体和毒素，免疫调节等功能[20-21]。如图2所示(具体数值见附表S1)， Cy能够造成IgA分泌细胞数量和sIgA含量显著降低，给予冬虫夏草各组分后，除NCS组外其它各组均能显著提高IgA分泌细胞的数量，而只有NCS、EE、WE-S组对sIgA含量有明显提高作用，前期研究发现WE-S的黄酮、多酚和蛋白质含量较高，而原料组的多糖和黄酮含量较高，表明天然冬虫夏草不同组分对IgA分泌细胞和sIgA含量有一定的增强作用，且不同组分对两种细胞的影响程度各不相同，可能与各组分活性成分组成有关。

注：#P<0.05，##P<0.01表示与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01表示与模型组相比。

2.4 天然冬虫夏草不同组分对小鼠小肠细胞因子的影响

根据分化条件的不同，CD4+ T细胞可分为Th1、Th2、Th17和Treg 4种类型[22]。其中，Th17细胞是一种新定义的能够分泌IL-17、IL-21等的细胞亚群[23]，可介导宿主防御反应及组织免疫反应，对免疫性疾病具有重要调节作用[24]。另一方面，Treg细胞主要分泌TGF-β、IL-10等抗炎因子，可抑制过度的炎症反应。如图3所示(具体数值见附表S2)，与正常组相比，模型组的IL-17和TGF-β3含量均有显著下降(P<0.05)。与模型组相比，除NCS和WE组外，其他各组分均能明显提高IL-17的含量，其中EE、NCSP和NCSP-50组效果最为显著；除NCS和WE-S外，其它各组分的TGF-β3含量也有明显提升。以上结果说明天然冬虫夏草不同组分能在一定程度上提高Cy造成的Th17和Treg型细胞因子的减少，从而调节肠道免疫，维护肠道健康。

注：#P<0.05，##P<0.01表示与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01表示与模型组相比。

2.5 天然冬虫夏草不同组分对小鼠小肠转录因子的影响

RORγt是Th17细胞的关键转录因子，能够调控Th17细胞及其分泌的相关细胞因子的表达[25]，Foxp3是Treg细胞的转录因子，可控制Treg细胞的分泌[26]，RORγt/Foxp3平衡可确定初始T细胞受抗原刺激后的分化方向[27]，对维持自身免疫稳态具有重要意义。如图4所示(具体数值见附表S3)，给与Cy后RORγt 的mRNA表达显著增高，Foxp3显著降低(P<0.01)。给药后，除NCS和REE组，其他各组分的RORγt均有明显降低，而只有EE和NCSP组对Foxp3的表达有显著提高；同时除NCS和REE组外，其它各组均能调节RORγt与Foxp3的比值，使RORγt/Foxp3趋于正常。以上结果表明天然冬虫夏草不同组分可以调整RORγt及Foxp3平衡进而调节肠道免疫。

注：#P<0.05，##P<0.01表示与正常组相比，*P<0.05，**P<0.01表示与模型组相比。

3 结论

天然冬虫夏草不同组分能够调节免疫器官指数，并且能够修复小肠紧密连接蛋白表达，提高IgA分泌细胞数量及sIgA含量，调节Th17和Treg相关细胞因子及关键转录因子来发挥肠道免疫，缓解肠道损伤。从总体来看，提取物效果要优于原料，不同提取物中，乙醇提取物(EE,WE-S)和多糖组(NCSP,NCSP-50)对Th17和Treg相关细胞因子及转录因子的表达作用效果相对优于其它组分，此外EE和WE-S对免疫器官指数，sIgA含量也有较好的调节作用。结合前期研究结果，与其他组相比，NCSP和NCSP-50糖含量较高(53.05 g/100 g、79.41 g/100 g)，WE-S中蛋白质和总酚含量最高(7.95 g/100 g、19.93 mg/g)，EE和WE-S中黄酮类化合物含量较高(18.64、16.82 mg/g)，推测提取过程有利于活性成分的积累，而活性成分的单独或相互作用可能对不同组分发挥作用机制的影响也各不相同。实验研究结果可为未来深度解析冬虫夏草药效关系提供数据支撑。