基于Myh6启动子的药物筛选系统在中药有效成分诱导P19向心肌细胞分化中的应用

李涵，邵长乐，王亚超，邵水金，国海东

上海中医药大学基础医学院人体解剖学教研室，上海 201203

心血管疾病是当今世界人类死亡的最主要原因，尤其是心肌梗死（myocardial infarction，MI）病死率呈快速上升趋势[1]。MI 发生后，死亡的心肌细胞被成纤维细胞所代替，引起心室重构和瘢痕形成，最终可能导致心力衰竭，甚至死亡。近20 年，通过干细胞移植修复坏死心肌为治疗MI 带来新的希望[2]，但由于心肌局部组织缺血缺氧，严重影响干细胞移植后的存活和分化效率[3]，尤其是干细胞只有分化为心肌细胞后，才能发挥替代坏死心肌细胞的作用，从而达到治疗MI 的目的。干细胞移植后向功能性心肌细胞定向分化需要精细的调控和合适的诱导环境[4]。

诱导干细胞向心肌细胞分化的手段主要包括拟胚体生成法、细胞共培养、生长因子等方法[5]。这些诱导方法需要进一步优化以提高诱导效率及诱导后心肌细胞的功能。中药可能含有诱导干细胞向心肌细胞分化的有效成分。已有诸多关于中药有效成分诱导干细胞向心肌细胞分化的研究报道[6]。三七是临床治疗心血管疾病的常用中药，含有多种三七皂苷和人参皂苷，其是否对干细胞向心肌细胞分化具有一定的诱导作用值得研究。然而，目前有关中药诱导干细胞定向分化的研究比较单一，缺乏有效的筛选措施，不能系统地比较各种有效成分的诱导效率。

由Myh6 编码的α-肌球蛋白重链（α-myosin heavy chain，α-MHC）是心肌特有的蛋白[7]。虽然心肌肌球蛋白轻链2V（myosin light chain 2V，MLC2V）和心肌肌钙蛋白T（cTnT）启动子也能作为向心肌分化的标记，但Myh6 启动子向心肌分化的特异性高于MLC2V 和cTnT 启动子，因此，用Myh6 示踪干细胞向心肌细胞分化的特异性比MLC2V 和cTnT 高[8]。本研究将Myh6 基因的启动子区域克隆并插入pGL6报告质粒荧光素酶基因的上游，构建心肌细胞特异启动子荧光素酶报告基因系统（Myh6-Luc），以高效灵敏地筛选向心肌细胞分化的中药诱导剂。

1 实验材料

1.1 药物

三七素（批号19103029）、三七皂苷Fa（批号19050623）、三七皂苷Fe（批号19102821）、三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，NGR1，批号19071624）、人参皂苷Rb1（批号19030522）、人参皂苷Rb2（批号19090421）及人参皂苷Rh1（批号19011421），上海同田生物技术公司，纯度≥98%。

1.2 细胞

小鼠畸胎瘤细胞P19，赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.3 主要试剂与仪器

无内毒素质粒大提试剂盒（货号DP117）、miRcute miRNA 提取分离试剂盒（货号DP501）、miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒（货号FP411），天根生化科技有限公司；DH5α 感受态（货号D0351）、pGL6 质粒（货号D2102），上海碧云天生物技术有限公司；限制性内切酶KpnⅠ（货号R3142S）、BglⅡ（货号R0144S），美国New England Biolabs；PCR 试剂盒（货号B639293），生工生物工程（上海）股份有限公司；MEM-α 培养基（货号iCell-0003），赛百慷（上海）生物技术股份有限公司；0.25%胰蛋白酶（货号25-053-CIa）、PBS（货号21-040-CV）、双抗（货号30-002-CIa），美国Corning；澳洲胎牛血清（货号10099141C）、转染试剂Lipofectamine 2000（货号11668-027），美国Thermo Fisher Scientific；二甲基亚砜（DMSO，货号D2650-5X10ML），美国Sigma-Aldrich；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（货号E1910），美国Promega 公司；cTnT 抗体（货号15513-1-AP），美国Proteintech 公司；荧光二抗（货号4412S），美国CST 公司；VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂（货号H-1200），美国Vector Labs 公司。全自动凝胶成像系统（2500R，上海天能），电泳仪（EPS300，上海天能），电热恒温水浴锅（HWS-24，上海一恒），多功能酶标仪（Synergy HT，美国BioTek 公司），细胞培养箱（371，美国Thermo Fisher Scientific），倒置荧光显微镜（IX51，日本Olympus 公司）。

2 实验方法

2.1 Myh6-Luc 重组质粒构建

根据pGL6 上的酶切位点和Myh6启动子序列（～1 507 bp），选择KpnⅠ和BglⅡ双酶切，将酶切位点引入PCR 产物中。用P19 细胞基因组作为模板，通过PCR 调取Myh6 启动子序列。将PCR 产物进行跑胶回收，37 ℃水浴锅进行KpnⅠ和BglⅡ双酶切反应。同时对pGL6 进行KpnⅠ和BglⅡ双酶切。将酶切后pGL6 载体和酶切后Myh6 通过T4 DNA 连接酶进行连接。取上述连接产物转化DH5α 感受态，涂板过夜培养。筛选阳性克隆用双酶切进行鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序。

2.2 P19 细胞培养

将P19 细胞接种于25 cm2细胞培养瓶，用含10%胎牛血清和1%双抗的MEM-α 培养基常规培养，待细胞生长至80%～90%进行细胞传代。将细胞接种至24 孔板，设置不同分组，培养24 h。

2.3 质粒转染

细胞接种后培养24 h，待细胞密度达到70%～80%，进行质粒转染，转染前1 h 更换不含血清的培养液，随后将质粒pRL-SV40 和Myh6-Luc 按1∶15比例通过转染试剂Lipofectamine 2000 进行转染，转染试剂与质粒的比例为2∶1，转染混合物与培养基的比例为1∶10。转染6～8 h 后吸弃培养基，换成新的完全培养基。转染第2 日使用诱导剂进行诱导，诱导7 d，期间每日更换含诱导剂的培养基。

2.4 双荧光素酶检测

诱导结束后吸去细胞上清液，PBS 漂洗细胞，加入1×PLB 裂解液，室温轻轻晃动培养板15 min 进行裂解，裂解结束后将液体吸出，12 000 r/min 离心5 min，吸取上清液，置于黑色圆底96 孔板，每孔加入20 μL上清液。设置自动进样器1 和2 分别为LARⅡ和Stop&Glo®试剂，每孔加入100 μL LARⅡ检测萤火虫荧光素酶活性，然后加入100 μL Stop&Glo®试剂检测海肾荧光素酶活性，检测时设置1～2 s 延迟和5～10 s 读数，之后对检测数据进行统计分析。

2.5 免疫荧光染色

诱导结束后，吸去细胞上清液，PBS 清洗2 次，4%多聚甲醛固定30 min；滴加0.5% Triton X-100，室温处理10 min 破膜，增加细胞膜通透性；PBS 洗3次；山羊血清37 ℃封闭30 min，封闭非特异性结合位点；滴加cTnT 一抗（1∶50）于4 ℃下孵育过夜；PBS 洗3 次，滴加荧光二抗（1∶500），37 ℃孵育1 h；PBS 洗3 次，每次10 min。抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察并进行拍照。

2.6 RT-qPCR 检测

诱导结束后，通过miRcute miRNA 提取分离试剂盒提取细胞miRNA，每组各取1 μg miRNA，采用miRNA 逆转录试剂盒进行逆转录。将miRcute 增强型miRNA 荧光定量检测试剂盒中 2×miRcute Plus miRNA Premix、Reverse Primer 和50×ROX Reference Dye 在冰上融化，配制反应体系后进行qPCR 检测。反应条件：95 ℃变性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45 个循环。

3 统计学方法

以萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值比值计算相对荧光素酶活性。采用SPSS23.0 统计软件进行分析。实验数据以表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较用方差分析（LSD-t）。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 Myh6-Luc 构建与鉴定

琼脂糖凝胶电泳成像显示，KpnⅠ/BglⅡ双酶切后出现1 507 bp 和5.5 k 两条特异性条带，条带大小与理论值相吻合，见图1。经基因测序后发现，插入的基因序列与Myh6 启动子序列完全一致。表明心肌细胞特异启动子Myh6-Luc 重组质粒构建成功，可用于后续筛选实验。

图1 Myh6-Luc 报告质粒的构建与酶切鉴定

4.2 荧光素酶报告基因体系验证

实验分为对照组（包括未转染和转染）和阳性诱导剂DMSO 组（包括未转染和转染）。DMSO 浓度为0.005%，诱导7 d 后进行双荧光素酶活性检测。结果显示，未转染的对照组和DMSO 组相对荧光素酶活性较低。与对照组（转染）比较，DMSO 组（转染）相对荧光素酶活性显著提高，表明荧光素酶报告基因体系建立成功，见图2。

4.3 中药单体筛选

利用荧光素酶报告基因系统对三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 及人参皂苷Rh1 共7 种中药单体进行筛选。每种药物设置0.01、0.1、1、10 μmol/L 4 个浓度，对照组不加任何诱导剂。诱导7 d 后进行双荧光素酶活性检测。结果显示，与对照组比较，0.1 μmol/L 三七皂苷Fe、1 μmol/L NGR1 和10 μmol/L 人参皂苷Rh1 组相对荧光素酶活性显著升高，其中1 μmol/L NGR1 诱导效果最明显。低浓度三七素（0.01、0.1、1 μmol/L）、高浓度三七皂苷Fe（1、10 μmol/L）及中浓度人参皂苷Rb2（0.1、1 μmol/L）能显著抑制相对荧光素酶活性，见图3。

图3 不同浓度三七素、三七皂苷Fa、三七皂苷Fe、NGR1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2 和人参皂苷Rh1 对Myh6 启动子活性的影响（，n＝6）

4.4 1 μmol/L NGR1 诱导效果验证

通过免疫荧光染色验证1 μmol/L NGR1 诱导P19细胞向心肌细胞分化效果，实验分为P19 组和P19＋NGR1 组。结果显示，1 μmol/L NGR1 诱导7 d 后，大部分P19 细胞表达cTnT，表明1 μmol/L NGR1 能成功诱导P19 细胞向心肌细胞分化，见图4。

图4 NGR1 诱导后P19 细胞cTnT 阳性表达（免疫荧光染色，Bar＝100 μm）

4.5 1 μmol/L NGR1 对P19 细胞miR-1 和miR-25 表达的影响

为进一步探讨1 μmol/L NGR1 诱导P19 细胞向心肌细胞分化的作用机制，通过RT-qPCR 检测诱导7 d后miR-1 和miR-25 mRNA 表达，实验分为P19 组和P19＋NGR1 组。结果显示，与P19 组比较，1 μmol/L NGR1 诱导后miR-1 表达显著升高，miR-25 表达显著降低（P＜0.01），见图5。

图5 NGR1 对P19 细胞miR-1 和miR-25 表达的影响（，n＝6）

5 讨论

双荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。可以通过化学发光仪检测氧化过程中释放的生物荧光，从而灵敏、高效地检测基因的表达，是检测转录因子与目的基因启动子区DNA 相互作用的一种方法。萤火虫荧光素和海肾荧光素是常用的报告基因，通过氧化不同底物产生可定量的荧光[9]。Koley 等[10]采用心钠素（atrial natriuretic factor，ANF）启动子荧光素酶报告系统对小分子化合物进行筛选，发现VUT-MK142 可促进心脏前中胚层向心肌细胞分化。ANF 是一种主要在心肌细胞中合成的多肽激素。本研究中，我们将Myh6 基因的启动子区域克隆并插入pGL6 报告质粒荧光素酶基因的上游，得到报告质粒Myh6-Luc，构建心肌细胞特异启动子荧光素酶报告基因系统。琼脂糖凝胶电泳实验、基因测序和双荧光素酶报告基因检测结果显示，报告基因质粒Myh6-Luc 构建成功。

通过该筛选系统发现，药物浓度对诱导P19 细胞向心肌细胞分化具有较大的影响。如10 μmol/L 三七素对P19 细胞分化无影响，0.01、0.1、1 μmol/L 三七素却显著抑制荧光素酶活性；0.1 μmol/L 三七皂苷Fe可促进P19 细胞向心肌细胞分化，而1、10 μmol/L 三七皂苷Fe 可抑制P19 细胞向心肌细胞分化；1 μmol/L NGR1 诱导效果十分明显。李晨琳等[11]发现，中浓度牡蛎蛋白肽对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）诱导分化作用最强，且显著高于高浓度的诱导作用。低浓度骨碎补总黄酮能促进大鼠BMSCs 向成骨细胞分化[12]。也有研究发现，中浓度5-氮胞苷是诱导BMSCs向心肌细胞分化的最适浓度[13]。因此，在中药单体筛选中应重视药物不同浓度的影响。此外，本研究只检测了7 种中药单体的诱导作用，在今后的研究中，可利用该系统对更多的中药单体成分进行检测，尤其临床治疗心血管疾病的常用中药单体，从而筛选出更为有效的中药诱导剂。

NGR1 是中药三七的主要活性成分，其能保护H9C2 心肌细胞对抗缺氧损伤[14]，提高H9C2 细胞的存活率，维持肌动蛋白骨架和线粒体形态，减少氧糖剥夺后复氧诱导的细胞凋亡[15]，对心肌细胞有直接的抗炎、抗凋亡作用[16]。还有研究发现，三七总皂苷能促进BMSCs 体外增殖和向心肌样细胞分化[17]。P19细胞是体外细胞诱导分化最常用的细胞系，虽然本研究发现1 μmol/L NGR1可激活P19细胞Myh6启动子，并通过免疫荧光染色进行验证，但仍应在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和诱导性多能干细胞上进一步验证，并在此基础上开展动物实验，为临床应用NGR1 治疗缺血性心肌病提供更多实验依据。此外，除用DMSO 作为阳性诱导剂外，10 nmol/L 全反式维甲酸也可促进ESC 向心肌细胞分化[18]。

在干细胞向心肌细胞分化的过程中多种miRNA表达发生变化。miR-1 在调控心肌祖细胞分化中起着重要作用，可促进移植ESC 向心肌细胞分化，并抑制MI 后细胞凋亡[19]。miR-1 和miR-133 可能在小鼠ESC 心肌细胞分化过程中发挥重要作用，并且Cdk9可能作为miR-1 的靶点参与这一过程[20]。有研究发现，miR-25 能明显抑制P19 细胞向心肌细胞分化，其作用机制可能与调控Notch 信号通路有关[21]。本实验发现，1 μmol/L NGR1 诱导后可显著提高miR-1 的表达，同时抑制miR-25 的表达。因此，NGR1 诱导P19 细胞向心肌细胞分化的机制可能与上调miR-1 和下调miR-25 的表达有关，其具体作用机制需进一步研究。

综上，本研究成功构建双荧光素酶报告基因系统Myh6-Luc，通过该系统可有效筛选向心肌细胞分化的中药有效成分，并且发现1 μmol/L NGR1 能成功诱导P19 细胞向心肌细胞分化，其作用机制与上调miR-1表达、下调miR-25 表达有关。本研究为诱导干细胞向心肌细胞分化提供了新的手段和工具，也为优化干细胞移植治疗MI 等心血管疾病提供了参考和依据。