茎瘤芥抗根肿病育种材料筛选与创制

2021-10-12彭丽莎沈进娟冷容王浩管中荣张召荣杨平范永红

植物保护 2021年5期

关键词：白菜

彭丽莎沈进娟冷容王浩管中荣张召荣杨平范永红

摘要为更好地防治茎瘤芥根肿病，本研究通过采用田间自然诱发和室内人工接种根肿菌的鉴定方法，对14份材料进行根肿病抗性鉴定，筛选出5份可作为茎瘤芥抗根肿病育种材料创制的抗性资源：‘中芜‘CR云‘华双5R‘CR春丽和‘CR-英雄用两种方法鉴定均表现高抗或免疫根肿病。利用‘CR云作为抗根肿病基因的供体亲本进行茎瘤芥抗根肿病材料的创制，获得茎瘤芥和白菜种间杂交的F1，结合形态学鉴定和根肿病抗性鉴定确定为真杂种。

关键词茎瘤芥; 白菜; 根肿病; 种间杂交

中图分类号： S 436.37

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2021136

Screening and creation of Brassica juncea var. tumida breeding materials resistant to clubroot

PENG Lisha， SHEN Jinjuan*， LENG Rong， WANG Hao， GUAN Zhongrong，ZHANG Zhaorong， YANG Ping， FAN Yonghong

（Chongqing Yudongnan Academy of Agricultural Sciences， Fuling 408000， China）

Abstract

Two methods of natural identification in the field and inoculation identification were used to evaluate the clubroot resistance of 14 materials. Five materials were recommended as resistance resources to creat B.juncea var. tumida breeding materials resistant to clubroot. Resistance evaluation of ‘Zhongwu ‘CR Yun ‘Huashuang 5R ‘CR Chunli and ‘CR-Yingxiong by two methods showed high resistance or immune to clubroot. Using ‘CR Yun as donor parents with resistance gene， B.juncea breeding materials resistant to clubroot were created. F1 generation of hybrids between B.juncea var. tumida and B.campestris were developed and identified by morphology and resistance evaluation.

Key words

Brassica juncea var. tumida; Brassica campestris; clubroot; interspecific hybridization

茎瘤芥Brassica juncea var. tumida 俗称为青菜头，其食用器官——茎[1]的加工产品榨菜是我国的副食珍品，长期以来受到国内外消费者的普遍欢迎。尤其是“涪陵榨菜”，因其“鲜、香、嫩、脆”的独特品质以及营养丰富、方便可口和耐储存耐烹调等许多优点，在国内外享有盛誉。同时，茎瘤芥种植生产业的发展促进和带动了榨菜加工业以及相关行业的发展，形成了一个以茎瘤芥种植、榨菜加工为中心的互为依存，又相互促进的大产业体系。

根肿病是十字花科作物的主要病害之一，在全球范围内广泛发生，已经造成粮油、蔬菜等产业的巨大经济损失。近年来随着十字花科作物栽培面积扩大和种植集约化程度的不断提高，根肿病在大面积生产上危害日益严重，威胁着茎瘤芥产业的健康发展[2]。目前生产上基本无抗根肿病茎瘤芥品种，已成为茎瘤芥原料生产亟待解决的重大现实问题。筛选十字花科作物中的抗根肿病种质资源，创制抗根肿病茎瘤芥材料，从而培育抗根肿病的品种并加以推广是解决根肿病最经济有效的途径[3]。深度发掘十字花科作物抗根肿病种质、强化育种创新基础，为建设现代种业强国、保障国家粮食安全、实施乡村振兴战略奠定堅实基础。其他十字花科作物开展根肿病抗性鉴定工作较早，大白菜、甘蓝、油菜等[4-8]都已经鉴定筛选出一批抗根肿病栽培品种。对十字花科作物芜菁、青花菜、萝卜、白菜、甘蓝和油菜等大量筛选后也获得了一些宝贵的抗根肿病资源。其中欧洲饲用芜菁中含有的抗根肿病位点最多，在抗病育种应用中也最为广泛[9]，Yoshikawa[10]从1 062份芸薹属种质资源中筛选出43份芜菁高抗病品系。有报道表明芸薹属A基因组较C基因组的抗源丰富[11]。张小丽等[12]在青花菜中鉴定筛选出5份中抗根肿病材料。Kamei等[13]从萝卜中发现对根肿病免疫的抗性位点，而Chen等[14]将萝卜与白花芥蓝杂交，得到对根肿病表现免疫的萝卜-芥蓝异源四倍体材料。采用胚挽救技术得到抗根肿病的甘蓝×大白菜和甘蓝型油菜新材料[15-16]。对茎瘤芥开展抗根肿病材料筛选与创制工作相对较晚，发现的抗病种质较少，抗病育种工作进展十分缓慢。因此，本研究通过筛选出抗根肿病材料，利用种间杂交获得抗根肿病的茎瘤芥×白菜材料，最终将白菜中的抗病基因转移到茎瘤芥中，旨在为茎瘤芥抗根肿病育种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试根肿菌

茎瘤芥肿根来自重庆市涪陵区，使用Williams鉴定系统将其病原菌鉴定为4号生理小种。肿根保存于-20℃冰箱内备用。

1.1.2 供试植物

感病品种：茎瘤芥‘永安小叶为生产中较为感病的品种，将其作为感病对照，茎瘤芥‘JL-2‘JL-5和‘JL-9多次鉴定表现为感病，均由重庆市渝东南农业科学院提供。

抗病性鉴定材料：芜菁‘中芜由中国农业科学院提供;甘蓝型油菜‘华双5R由华中农业大学提供;白菜‘CR云为从云南收集的材料;白菜‘四季娃娃菜‘四季黄芯‘怀春‘CR-春美‘CR中联金宝‘靓根CR1‘CR117‘CR-英雄‘CR爱民‘CR95和‘CR春丽均购买于市场。

1.2 试验方法

1.2.1 田间自然诱发鉴定

2020年9月-12月，于重慶市涪陵区江北街道二渡村，前茬为水稻的根肿病重病田进行田间自然诱发鉴定。每份材料播30穴，每穴1株，3次重复，同时按照随机区组排列。播种后按常规栽培方式管理。收获期后拔出并洗净根部进行发病情况的调查。

1.2.2 休眠孢子悬浮液的制备

休眠孢子悬浮液的制备参考郭向华等[17]的方法。

1.2.3 室内人工接种鉴定

在无菌土中加入休眠孢子悬浮液，使菌土中孢子含量达到2×108 个/g，用石灰和硫酸铝将土壤pH调至5.5，菌土含水量控制在60%左右，将混匀的菌土分装至8 cm×8 cm的营养钵中。每份材料30钵，每钵1株，重复3次。接种后的材料置于昼夜温度26℃/20℃（白天/黑夜），光照强度200 μmol/（m2·s），光周期L∥D=16 h∥8 h的可控培养箱中，定期浇灌自来水。播种50 d后拔出茎瘤芥植株并洗净其根系，调查植株发病情况。

1.2.4 杂交及亲和指数测定

2019年10月，将茎瘤芥和白菜‘CR云移栽于重庆市渝东南农业科学院试验地，进行正常的肥水管理。翌年4月初采集白菜‘CR云的花粉分别在茎瘤芥‘JL-2‘JL-5和‘JL-9植株上进行人工蕾期授粉。待结实成熟后收集角果，统计角果里的饱满籽粒数。

1.2.5 调查及统计

单株分级标准参考司军等[18]的方法。0级：根系生长正常、无肿瘤;1级：根系主根不发病或膨大不明显，直径≤2倍茎基部或须根有小肿瘤;2级：主根明显肿大，2倍茎基部<直径≤3倍茎基部;3级：主根明显肿大，3倍茎基部<直径≤4倍茎基部;4级：主根明显肿大，直径>4倍以上茎基部或根部发黑腐烂，无须根。

发病率=（染病株数/调查总株数）×100%;

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）。

抗病性分级标准参照杨晓云等[19]的方法，分为5级，即免疫（I）：病情指数=0，高抗（HR）：0 <病情指数≤11.11，抗病（R）：11.11<病情指数≤33.33，感病（S）：33.33<病情指数≤55.55，高感（HS）：病情指数>55.55。

亲和指数=结籽数/授粉花数。

1.2.6 数据统计分析

试验数据用Excel 2010软件处理，用DPS 1450软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同材料对根肿病的抗性鉴定

2.1.1 田间自然诱发鉴定

采用田间自然诱发鉴定，以茎瘤芥‘永安小叶为感病对照，对14份材料进行根肿病的抗性鉴定。其中免疫材料3份，分别为芜菁‘中芜、甘蓝型油菜‘华双5R和白菜‘CR云，占供试材料的21.43%。高抗材料4份，分别为白菜‘CR-英雄‘CR爱民‘CR95和‘CR春丽，占供试材料的28.57%。高抗材料中白菜‘CR春丽病情指数最低，为0.87，显著低于‘CR爱民 ‘CR-英雄，而与‘CR95差异不显著;其发病率也最低，为（1.672.36）%，极显著低于‘CR95‘CR爱民 ‘CR-英雄。抗病材料7份，分别为白菜‘四季娃娃菜‘四季黄芯‘怀春‘CR-春美‘CR中联金宝‘靓根CR1‘CR117，占供试材料的50.00%。14份供试材料在田间自然诱发鉴定中均未被鉴定为感病。

2.1.2 室内人工接种鉴定

采用室内人工接种鉴定，以茎瘤芥‘永安小叶为感病对照，对14份材料进行根肿病的抗性鉴定。抗病性鉴定结果显示不同材料的抗病性存在较大差异。免疫材料1份，为芜菁‘中芜，占供试材料的7.14%。高抗材料4份，分别为白菜‘CR-英雄‘CR春丽‘CR云和甘蓝型油菜‘华双5R，占供试材料的28.57%。其中甘蓝型油菜‘华双5R的发病率极显著低于白菜‘CR云和‘CR-英雄，病情指数显著低于其他3种高抗材料。抗病材料6份，分别为白菜‘怀春‘CR117‘CR爱民‘CR95‘靓根CR1和‘CR中联金宝，占供试材料的42.86%。感病材料1份，为白菜‘CR-春美，占供试材料的7.14%。高感病材料2份，分别为白菜‘四季娃娃菜和‘四季黄芯，占供试材料的14.29%。其中白菜‘四季娃娃菜的病情指数（75.676.99），极显著高于白菜‘四季黄芯。

基于两种方法对14份材料的鉴定结果，用两种方法鉴定均表现高抗或免疫根肿病的材料有5份，分别是‘中芜‘CR云‘华双5R‘CR春丽和‘CR-英雄。采用两种方法鉴定都表现为抗病的材料有‘CR怀春‘CR117‘靓根CR1和‘CR中联金宝4份材料。至少有1种方法鉴定为感病或高感的材料有‘CR-春美‘四季娃娃菜和‘四季黄芯3份。‘CR爱民和‘CR952份材料采用田间自然诱发鉴定的抗病性表现优于室内人工接种鉴定的结果。

2.2 茎瘤芥抗根肿病材料的创制

2.2.1 茎瘤芥与白菜‘CR云种间杂交亲和性研究

挑选3份茎瘤芥作为母本，白菜‘CR云作为父本，采取人工蕾期授粉的方式创制茎瘤芥×白菜材料。从表3的统计结果来看，3份茎瘤芥与白菜‘CR云种间杂交的亲和性不一样，其中‘JL-5与‘CR云种间杂交的亲和性最好，亲和指数为3.17，与组合‘JL-2×CR云的亲和性差异不显著。而‘JL-9与白菜‘CR云的亲和性最差，亲和指数极显著低于组合‘JL-5×CR云和‘JL-2×CR云（图2）。

2.2.2 F1材料真伪杂种鉴定

种间杂交获得的F1材料，移栽到大田后植株生长状况良好。形态学上既表现出茎瘤芥的瘤茎突起，又表现出白菜薹生叶呈环抱状态的特点，开展度較大，不包心。与茎瘤芥比较，成株期叶片数量变多，叶柄变宽，长度介于茎瘤芥和白菜之间，叶表面有刺毛，具有白菜叶片的特点（图3）。对F1材料进行根肿病抗性鉴定，根系生长正常，无肿根，天气晴朗时植株生长正常，无萎蔫，表现为抗病（图4）。总结以上农艺性状和抗病性并与茎瘤芥、白菜比较发现，可以判断其为茎瘤芥与白菜杂交后形成的真杂种。

3 讨论

茎瘤芥对根肿病的抗性本质上是由其本身的抗病基因控制，亦受环境条件、根肿菌数量和致病力的影响。本试验采用田间自然诱发和室内人工接种鉴定两种方法进行根肿病抗性鉴定，9份材料的抗性分级因鉴定方法的不同而出现不同的结果，在这之前甘彩霞等[20]也发现苗期抗性鉴定病情指数高，成株鉴定时病情指数不一定高。与李慧楠等的研究结果不一样[21]，可能是由于田间自然诱发鉴定法采用的根肿病田里根肿菌分布不如室内人工接种鉴定均匀一致，环境条件也达不到统一可控。采用室内人工接种鉴定法的根肿病发病率和病情指数绝大部分高于田间自然诱发鉴定，可能是室内环境条件为根肿病发生较为适宜的条件。然而室内人工接种鉴定，挑选的根肿菌较田间的代表性差[22]。本试验将田间和室内试验相结合，提高了鉴定结果的可靠性。经过两种方法鉴定的14份材料对根肿病的抗性，其中均表现高抗或免疫根肿病的5份材料，为‘中芜‘CR云‘华双5R‘CR春丽和‘CR-英雄，这些品种可以在重庆市涪陵区根肿病区种植，也可以作为茎瘤芥抗根肿病材料创制的抗性资源。至少有1种方法鉴定为感病的材料有‘CR-春美‘四季娃娃菜和‘四季黄芯3份，不适宜在根肿病区种植。

茎瘤芥和白菜同属于十字花科作物，但是两个不同种。十字花科作物种间杂交报道非常多，成功地获得种间杂交种的案例也很多，有的材料通过抗根肿病鉴定也表现为抗病[23-25]。而关于茎瘤芥与其他十字花科作物杂交的研究还未发现。邓婧等[26]在文章中指出芸薹属作物种间杂交时，具有部分同源染色体组的两个亲本亲和性较强。也有研究表明染色体组AABB的作物和染色体组AA的作物杂交容易得到杂种[27-28]。故本试验选用经两种方法鉴定都表现抗根肿病的白菜品种‘CR云作为CR基因的来源，大大地增加了在F1中筛选到抗病材料的机会。本研究发现，杂交所用的茎瘤芥基因型对亲和指数有影响，茎瘤芥母本选用‘JL-5和‘JL-2时，种间杂交亲和性好。王国槐等[29]和廖慧敏[30]的研究证明十字花科种间杂种的营养优势十分显著。本研究种间杂交获得的F1杂种优势表现明显，兼具茎瘤芥和白菜农艺性状的特点，最为明显之处是既表现出茎瘤芥的瘤茎突起，又表现出白菜薹生叶呈环抱状态。

本试验采用两种鉴定方法筛选出5份可以作为茎瘤芥（榨菜）抗根肿病材料创制的抗性资源，分别是‘中芜‘CR云‘华双5R‘CR春丽和‘CR-英雄，进而获得茎瘤芥和白菜种间杂交的F1，结合形态学鉴定和根肿病抗性鉴定确定为真杂种。该材料将为通过回交转育、抗病性鉴定和分子标记辅助选择（MAS），最终获得茎瘤芥抗根肿病新材料奠定基础。

参考文献

[1] ZHANG Lili， LI Zhangping， GARRAWAY J， et al. The casein kinase 2 β subunit CK2B1 is required for swollen stem formation via cell cycle control in vegetable Brassica juncea [J]. The Plant Journal， 2020， 104（3）： 706-717.

[2] 王旭祎，高明泉，彭洪江，等. 涪陵茎瘤芥根肿病调查与防治[J]. 长江蔬菜， 2004（5）： 38-39.

[3] DIEDERICHSEN E， FRAUEN M， LINDERS E G A， et al. Status and perspectives of clubroot resistance breeding in crucifer crops [J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2009， 28（3）： 265-281.

[4] 任星魁，郭莹，曹玉平，等. 抗根肿病大白菜新品种琴萌CR1239[J]. 中国蔬菜， 2019（4）： 110-111.

[5] 司军，李成琼，宋洪元，等. 结球甘蓝对根肿病的抗性鉴定与评价[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2009， 31（6）： 26-30.

[6] 张小丽，单晓政，顾宏辉，等. 甘蓝类蔬菜品种（系）苗期根肿病抗性鉴定[J].植物保护， 2020， 46（5）： 193-199.

[7] 陈欣，王超，张晓烜，等. 甘蓝根肿病的人工接种体系与抗源材料筛选[J].植物保护， 2015， 41（5）： 121-126.

[8] 李倩， SHAH N，周元委，等. 抗根肿病甘蓝型油菜新品种华油杂62R的选育[J]. 作物学报， 2021， 47（2）： 28-41.

[9] PIAO Z， RAMCHIARY N， LIM Y P. Genetics of clubroot resistance in Brassica species [J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2009， 28（3）： 252-264.

[10]YOSHIKAWA H. Studies on breeding of clubroot resistance in cole crops [J]. Bulletin of the National Research Institute of Vegetables， Ornamental Plants and Tea. Series A， 1993， A7： 1-165.

[11]江莹芬，战宗祥，朴钟云，等. 油菜抗根肿病资源创新与利用的研究进展与展望[J]. 作物学报， 2018， 44（11）： 1592-1599.

[12]张小丽，刘玉梅，方智远，等. 青花菜及近缘种属种质资源抗根肿病鉴定[J]. 植物遗传资源学报， 2016， 17（6）： 1106-1115.

[13]KAMEI A， TSURO M， KUBO N， et al. QTL mapping of clubroot resistance in radish （Raphanus sativus L.） [J]. Theoretical & Applied Genetics， 2010， 120（5）： 1021-1027.

[14]CHEN H G， WU J S. Characterization of fertile amphidiploid between Raphanus sativus and Brassica alboglabra and the crossability with Brassica species [J]. Genetic Resources & Crop Evolution， 2008， 55： 143-150.

[15]彭丽莎，周俐利，任雪松，等. 用胚挽救法创建甘蓝×大白菜抗根肿病新材料[J]. 植物保护学报， 2016， 43（3）： 419-426.

[16]黄镇，徐爱遐，刘亚萍，等. 一种人工合成抗根腫病甘蓝型油菜新材料的方法： CN201610363713.3[P]. 2016-10-26.

[17]郭向华，肖崇刚，曾艳. 甘蓝根肿病菌生物学特性[J]. 西南大学学报（自然科学版）， 2001， 23（1）： 7-9.

[18]司军，宋洪元，任雪松，等. 一种利用荞麦防治甘蓝根肿病的栽培方法： CN201510809450.X [P]. 2017-11-07.

[19]杨晓云，张淑霞，张清霞，等. 抗根肿病大白菜品种对不同地区根肿病菌的抗性鉴定[J]. 中国蔬菜， 2015（6）： 38-41.

[20]甘彩霞，崔磊，袁伟玲，等. 湖北长阳山区萝卜根肿病抗性鉴定筛选[J]. 中国蔬菜， 2017（12）： 35-41.

[21]李慧楠，董军，王雅，等.抗根肿病大白菜品种抗性鉴定与性状评价[J].中国瓜菜， 2020， 33（7）： 39-43.

[22]黄小莉，任佐华，彭沙莎，等. 湖南白菜品种根肿病抗性鉴定及评价[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）， 2014， 40（1）： 43-47.

[23]余青青. 人工合成白花甘蓝型油菜抗根肿病特性遗传研究[D].雅安：四川农业大学， 2008.

[24]刘亚萍. 十字花科抗根肿病资源的筛选及甘蓝型油菜抗根肿病种质的创制[D].杨凌：西北农林科技大学， 2017.

[25]曾爱松，严继勇，陈龙正，等. 一种抗根肿病的甘蓝大白菜远缘杂种的创制方法： CN201611149186.2[P]. 2017-05-10.

[26]邓婧，李栒. 芸薹属植物远缘杂交不亲和性以及杂种后代遗传特性的研究进展[J]. 作物研究， 2006， 20（5）： 459-464.