葛根总皂苷调控NAMPT-Sirt1轴诱导BMSCs向髓核样细胞分化

岳宗进，刘汝银，于露，王新立，冯仲锴，王西彬

中老年人椎间盘退变加重常引起腰痛和下肢疼痛，甚至引起尿便失禁及其他功能障碍。椎间盘退变的典型症状是髓核细胞数目减少、椎间盘内细胞外基质减少、终板软骨钙化等［1］。其主要治疗方法包括基因治疗、细胞因子治疗、细胞或髓核移植及组织工程技术等［2-3］，但这些方法均无法恢复脊柱的原有解剖结构，甚至造成相邻椎间盘的病变。随着干细胞治疗研究的深入，诱导干细胞分化成髓核细胞修复椎间盘有望成为一种新治疗手段，但是其调控机制尚不清楚。葛根属于豆科植物，具有促进人体新陈代谢、提高肝脏解毒能力的功效。葛根中的三萜及皂苷类化合物主要为齐墩果烷型，主要有黄豆皂苷元A、B，葛根皂苷元A、B、C等。药理实验证明葛根总皂苷（total saponins of pueraria lobata，TSPL）可改善小鼠免疫性肝损伤［4］。目前有关TSPL促进软骨细胞增殖的研究鲜有报道。本研究旨在探讨TSPL对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）定向分化成髓核样细胞的调控作用及机制，为TSPL改善椎间盘退变提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和动物 大鼠BMSCs（Cat NO.RBM-005F）购自美国ALLCELLS公司。SPF级雄性SD大鼠32只，体质量（230±13）g，由河南省中医院（河南中医药大学第二附属医院）实验动物中心提供，动物生产许可证号SYXK（豫）2017-0012。饲养条件：温度为25℃，相对湿度为50%~70%，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气，自然光照，自由进食和饮水。大鼠适应性喂养1周后进行实验。所有动物实验均经河南省中医院实验动物伦理委员会批准（批准文号Z1.0/612）。

1.1.2 试剂 DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、Ⅱ型胶原蛋白酶、Alcian Blue、DMEM培养基（高糖）、胎牛血清（Sigma公司）；二甲基亚甲基蓝（DMMB）比色法定量检测试剂盒（上海赫澎生物公司）；引物合成（上海生工生物公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒、实时荧光PCR（qPCR）试剂（大连TaKaRa公司）；总蛋白提取试剂盒、Prestained Protein Ladder（Thermo Fisher Scientific公司）；Lipo‑fectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司）；兔抗COL2A1多克隆抗体（货号：ab34712）、兔抗Aggrecan单克隆抗体（Aggrecan，货号：ab186414）、兔抗Sox9单克隆抗体（货号：ab185230）、兔抗Tie2单克隆抗体（货号：ab221154）、兔抗Sirt1单克隆抗体（货号：ab189494）、山羊抗兔IgG（货号：ab205718）和过氧化物酶（HRP）购自英国Abcam公司；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）/NADH检测试剂盒（Biovision公司）；腺苷三磷酸（ATP）检测试剂盒（北京索莱宝公司）；烟酰胺单核苷酸（NMN）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂FK866（北京福珺生物科技有限公司）；沉默交配型信息调节2同系物1（Sirt1）检测试剂盒（美国Invitrogen公司）；细胞增殖检测试剂盒（CCK-8，北京百泰克生物公司）；去离子水设备Milli-Q水纯化系统（美国Millipore公司）；SRT2104试剂（上海普迈生物科技有限公司）。

1.1.3 仪器 细胞培养箱、酶标仪、凝胶成像系统（iBright）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；qPCR仪（型号：ABI-7300）购自美国ABI公司；蛋白免疫印迹电泳系统（型号1659001）购自美国Bio-Rad公司；紫外/可见分光光度计（型号752）购自上海光谱仪器有限公司；倒置电子显微镜（型号FM-500）购自上海普丹光学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠腰椎间盘退变模型 采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、30 mg/kg TSPL治疗组和50 mg/kg TSPL治疗组，每组8只。腹腔注射6.5%水合氯醛麻醉大鼠，取俯卧位，固定四肢，腰背部备皮，沿腰背部棘突做后正中切口。切开皮肤后，沿骨膜下剥离，咬骨钳去除以L3为中心的L1~S1的棘突、关节突和棘上及棘间韧带，切断双侧竖棘肌，逐层缝合皮下筋膜、皮肤。假手术组仅切开皮肤，然后进行缝合，处理结束后将大鼠放入单独笼中饲养。治疗组大鼠分别给予30、50 mg/（kg·d）TSPL灌胃治疗，假手术组和模型组大鼠给予等量生理盐水灌胃。饲喂8周后，处死大鼠，显微镜下采集大鼠L5~S1椎间盘组织。

1.2.2 TSPL的提取 采用乙醇热回流及大孔吸附树脂方法提取制备葛根总皂苷［3］，含量＞50%。称取葛根饮片1 kg（广州中医药大学大药房有限公司，批号：20100319），碾碎后，加入75%乙醇，水浴加热回流提取3次后，浓缩收集提取液，称质量。然后，大孔吸附树脂为固态相，分别用水和不同梯度（30%、40%、50%、60%和70%）乙醇进行洗脱，浓缩收集洗脱液，再次称质量。最后，将TSPL样品溶解于去离子水，质量浓度为2 g/L，去离子水作为参照组。采用分光光度计于400~800 nm处测定TSPL的吸光度。

1.2.3 BMSCs的培养和处理 取生长状况良好的大鼠BMSCs，使用含10%胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 U/mL青霉素的DMEM/F12培养液，在37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。当细胞融合度达80%时按1∶3传代，选取第3代细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为1×109/L，接种于6孔板中。体外实验分为：（1）BMSCs组，给予生理盐水处理。（2）BMSCs-TSPL组，分别给予不同剂量（10、20、30、40、50μmol/L）TSPL处理。（3）BMSCs-TSPL-FK866组，分别给予30μmol/L TSPL和2.5μmol/L FK866处理。（4）BMSCs-TSPL-SRT2104组，分别给予30μmol/L TSPL和10μmol/L SRT2104处理。

1.2.4 DMMB比色法检测糖胺聚糖含量 分别取各组大鼠L5~S1椎间盘组织0.5 g，加入1 mL HEPENGBIO清理液清洗1次，匀浆器研磨成匀浆，置于离心管中，加入5 mL HEPENGBIO萃取液，漩涡震荡后，分别在56℃恒温水槽中孵育16 h，90℃恒温水槽中孵育10 h。离心后取50μL上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO染色液，室温孵育30 min后，离心弃上清液，加入0.1 mL HEPENGBIO解离液，震荡后转移到比色皿中，在656 nm处用分光光度计检测吸光度值，根据标准曲线获得样品对应的糖胺聚糖含量。细胞实验中，收集第1、4、7、10、14天的细胞，通过高盐萃取细胞中可溶性糖胺聚糖，与DMMB染料结合，在丙醇解离溶液中，产生不溶性紫色或粉红色糖胺聚糖染料复合物释放出染料，分光光度计于656 nm处定量分析糖胺聚糖的含量，操作步骤同组织测定。

1.2.5 CCK-8法测定髓核样细胞增殖情况 按照CCK-8试剂盒检测各组细胞的增殖情况。将经过不同处理的细胞以1.5×104/孔的密度接种于96孔培养板中。孵育24、48和72 h后，丢弃上清液，并向每孔中添加10μL CCK-8溶液。37℃孵育2 h后，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.2.6 qPCR检测髓核样细胞中COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt 1mRNA水平 细胞诱导成熟后，用Trizol试剂盒提取细胞中总RNA。测定RNA浓度后，将RNA反转录成cDNA，以cDNA作为模板进行qPCR反应，根据试剂盒要求进行定量分析。反应体系：10×Taq bufffer 2.5μL，dNTP mix 2.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，RNase-free water补足至25μL。反应条件如下：95℃5 min；94℃15 s，54℃30 s，72℃20 s，共35个循环。以GAPDH为内参，基因引物序列见表1。采用2-ΔΔCt法计算各基因mRNA相对表达量。

1.2.7 Western blot测定COL2A1、Aggrecan、Sox9、Tie2和Sirt1蛋白的表达 细胞培养14 d后，使用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白，并溶解于SDS蛋白上样缓冲液中。每组取40μg上样蛋白，等量蛋白经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶分离后，转至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h，TSBT清洗后，加入兔抗COL2A1多克隆抗体（稀释比例1∶300），兔抗Aggrecan单克隆抗体（稀释比例1∶300），兔抗Sox9单克隆（稀释比例1∶500），兔抗Tie2单克隆抗体（稀释比例1∶200）和兔抗Sirt1单克隆抗体（稀释比例1∶100）于4℃冰箱中孵育过夜，经TBST漂洗后，与HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（稀释比例1∶1 000）室温孵育1 h，以GAPDH为内参。采用增强化学发光法显色，用凝胶成像仪观察条带并拍照，并用Image J软件对蛋白进行定量分析。

1.2.8 WST-8法检测各组骨髓间充质干细胞中NAD+水平 诱导培养14 d后，收集各组细胞，根据NAD+/NADH测定试剂盒的步骤进行操作，制作标准曲线后，计算NAD+的水平。

1.2.9 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测骨髓间充质干细胞中ATP水平及髓核样细胞的NAMPT水平 用离心管离心沉淀细胞，弃上清液，然后加入裂解液裂解细胞后，在4℃，12 000×g条件下离心10 min，取上清液，按照ATP试剂盒说明书检测ATP水平。按照ELISA试剂盒说明检测各处理组细胞中NAMPT水平，用酶标仪检测450 nm处吸光度，绘制标准曲线并计算NAMPT水平。

Tab.1 Primers for qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验；不同时点多组间比较采用重复测量设计的方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 椎间盘组织和BMSCs中糖胺聚糖含量比较 体内实验结果显示，假手术组、模型组和30、50 mg/kg TSPL治疗组椎间盘组织中糖胺聚糖含量（ng/g）分别为2.66±0.22、1.37±0.05、2.01±0.07和2.42±0.17，差异有统计学意义（F=3 694.896，P＜0.05）。其中模型组低于假手术组，30、50 mg/kg TSPL治疗组高于模型组，且50 mg/kg TSPL治疗组高于30 mg/kg TSPL治疗组（P＜0.05）。

体外实验结果显示，BMSCs组和不同剂量TSPL组细胞中糖胺聚糖含量随处理时间的延长呈增高趋势（P＜0.05）。除处理1 d时各组细胞中糖胺聚糖含量差异无统计学意义外，其余各时点TSPL各组糖胺聚糖含量均高于BMSCs组，10、20、30μmol/L TSPL组糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL组糖胺聚糖含量逐渐降低，见表2。故后续实验选择30μmol/L TSPL处理细胞。

不同处理组细胞中糖胺聚糖含量随处理时间的延长呈增高趋势（P＜0.05）。处理1 d时，各组细胞中糖胺聚糖含量差异无统计学意义（P＞0.05）；其余各时点，与BMSCs组比较，BMSCs-TSPL组、BMSCs-TSPL-SRT2104组糖胺聚糖含量均增高（P＜0.05），BMSCs-TSPL-FK866组差异无统计学意义（P＞0.05）；与BMSCs-TSPL组比较，BMSCs-TSPL-FK866组糖胺聚糖含量降低，BMSCs-TSPL-SRT2104组糖胺聚糖含量增高；与BMSCs-TSPL-FK866组比较，BMSCs-TSPL-SRT2104组糖胺聚糖含量明显增高（P＜0.05），见表3。

2.2 不同处理组BMSCs向髓核样细胞分化情况比较 BMSCs组细胞贴壁后逐渐显现出梭形、纺锤形；与BMSCs组比较，TSPL单独或联合SRT2014处理后的BMSCs细胞形态由梭形向多角形转变，核周颗粒明显，细胞表型接近髓核样细胞；与BMSCs-TSPL组比较，BMSCs-TSPL-FK866组BMSCs分化程度减少，而BMSCs-TSPL-SRT2014组促进BMSCs向髓核样细胞分化，见图1。

2.3 不同处理组BMSCs细胞增殖能力比较 不同处理组细胞增殖能力随处理时间的延长呈增强趋势（P＜0.05）。处理0 h时，各组细胞增殖能力差异无统计学意义（P＞0.05）；处理24 h时，BMSCs-TSPL组和BMSCs-TSPL-SRT2104组细胞增殖能力强于BMSCs组；处理48、72 h时，与BMSCs组相比，BMSCs-TSPL组和BMSCs-TSPL-SRT2104组细胞增殖能力增强；与BMSCs-TSPL组相比，BMSCs-TSPLFK866组细胞增殖能力减弱，BMSCs-TSPLSRT2104组细胞增殖能力增强；BMSCs-TSPLSRT2104组细胞增殖能力较BMSCs-TSPL-FK866组增强（P＜0.05），见表4。

Tab.2 Comparison of glycosaminoglycan contents in cells between the six treatment groups表2 BMSCs组和不同剂量TSPL组细胞各时点的糖胺聚糖含量比较 （n=4，mg/L，x±s）

Tab.3 Comparison of glycosaminoglycan contents between the four different treatment groups of cells表3 不同处理组细胞各时点的糖胺聚糖含量比较 （n=4，mg/L，x±s）

Fig.1 Cytographic view of BMSCs differentiated into nucleus pulposus like cells（×100）图1 BMSCs向髓核样细胞分化的细胞图（×100）

Tab.4 Comparison of cell proliferation between the four different treatment groups表4 不同处理组细胞增殖情况的比较 （n=4，x±s）

2.4 不同处理组BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2mRNA表达 qPCR结果显示，与BMSCs组相比，BMSCs-TSPL组和BMSCs-TSPL-SRT2104组COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表达水平升高，Tie2mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL组相比，BMSCs-TSPL-FK866组COL 2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表达水平降低，Tie2mRNA表达水平升高（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL-FK866组比较，BMSCs-TSPL-SRT2104组COL2A1、Aggrecan和Sox9mRNA表达水平升高，Tie2mRNA表达水平降低（P＜0.05），见表5。

Tab.5 Comparison of mRNA levels of COL2A1,Aggrecan,SOX9 and Tie2 in BMSCs between the four different treatment groups表5 不同处理组COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2 mRNA表达比较 （n=4，x±s）

2.5 不同处理组BMSCs中COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表达 Western blot结果显示，与BMSCs组相比，BMSCs-TSPL组和BMSCs-TSPL-SRT2104组COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表达水平升高，Tie2蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL组相比，BMSCs-TSPL-FK866组COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表达水平降低，Tie2蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL-FK866组比较，BMSCs-TSPL-SRT2104组COL2A1、Aggrecan和Sox9蛋白表达水平升高，Tie2蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图2、表6。

Fig.2 COL2A1,Aggrecan,Sox9 and Tie2 protein levels in TSPL-treated BMSCs图2 Western blot检测各组COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表达

Tab.6 Comparison of protein levels of genes in nucleus pulposus-like cells between the four different treatment groups表6 不同处理组COL2A1、Aggrecan、SOX9和Tie2蛋白表达比较 （n=4，x±s）

2.6 不同处理组BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平 ELISA结果显示，与BMSCs组相比，BMSCs-TSPL组和BMSCs-TSPL-SRT2104组BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL组相比，BMSCs-TSPL-FK866组BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平降低（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL-FK866组 比 较，BMSCs-TSPL-SRT2104组BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT水平升高（P＜0.05），见表7。

Tab.7 Comparison of the levels of NAD+,ATP and NAMPT in BMSCs between the four different treatment groups表7不同处理组BMSCs中NAD+、ATP和NAMPT相对水平的比较 （n=4，x±s）

2.7 不同处理组BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白的表达 与BMSCs组相比，TSPL单独或联合SRT2104处理显著上调BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表达水平（P＜0.05）；与BMSCs-TSPL组相比，BMSCs-TSPLFK866组细胞中Sirt1 mRNA和蛋白表达水平下调（P＜0.05），而BMSCs-TSPL-SRT2104组 细 胞 中Sirt1 mRNA和蛋白表达水平上调（P＜0.05），见表8、图3。

Tab.8 Comparison of Sirt1 mRNA and protein levels in BMSCs between the four different treatment groups表8不同处理组BMSCs中Sirt1 mRNA和蛋白表达水平的比较 （n=4，x±s）

Fig.3 Sirt1 protein level in myeloid cells图3 髓核样细胞相关蛋白的表达

3 讨论

有研究表明，牛膝皂苷、当归、梓醇、黄芪甲苷等中药及提取物均可促进BMSCs分化成髓核样细胞而改善椎间盘退化［5-8］。葛根素通过ERK1/2和P38MAPK途径促进成骨分化，改善去卵巢大鼠骨质疏松［9］。椎间盘退变的主要表现为细胞外基质成分的变化，尤其是糖胺多糖丢失［10］。因此，本研究分别测定大鼠椎间盘组织和BMSCs中糖胺聚糖含量来判断椎间盘退变情况，结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠椎间盘组织中糖胺聚糖含量降低；与模型组相比，TSPL治疗组糖胺聚糖含量增加，且50 mg/kg TSPL效果较30 mg/kg显著；体外实验结果显示，不同剂量TSPL组糖胺聚糖含量均高于BMSCs组，其中10、20、30μmol/L TSPL组糖胺聚糖含量依次升高，40、50μmol/L TSPL组糖胺聚糖含量逐渐降低，故后续实验选择30μmol/L TSPL处理细胞。

BMSCs具有多向分化能力，根据所处的微环境不同，可分化成神经细胞、心肌细胞和肝样细胞等［11-12］。椎间盘由外层的纤维环及其包绕的髓核构成，髓核由细胞和细胞外基质组成，基质主要包括水、蛋白多糖、胶原和非胶原蛋白。退变的椎间盘组织中，细胞外基质降解增强，导致髓核细胞内Ⅱ型胶原蛋白转变成Ⅰ型胶原蛋白［13］，糖胺聚糖含量降低。因此，研究BMSCs向髓核样细胞分化对椎间盘退变疾病的治疗具有重要意义。据报道，黄芪甲苷Ⅳ可通过调节糖原合成酶激酶（GSK）3β/β-连环蛋白信号通路促进神经生长因子（NGF）诱导的成骨细胞分化［14］。梓醇通过Wnt/β-catenin途径促进骨髓间充质干细胞的成骨分化［15］。本研究结果显示，BMSCs经TSPL处理后，BMSCs中糖胺聚糖含量增加，且促进BMSCs向髓核样细胞分化。COL2A1、Aggrecan、Sox9和Tie2作为髓核样细胞的特有基因，可用来判断BMSCs分化至髓核细胞的程度［16-17］。Liu等［18］研究表明椎间盘退变过程中Aggrecan蛋白表达量降低。本研究结果发现，BMSCs经TSPL处理可上调COL2A1、Aggrecan以及Sox9的mRNA和蛋白表达水平，并且下调Tie2 mRNA和蛋白表达水平。

NAD+是一种典型的辅酶，介导多种氧化还原反应，促进关键代谢途径中的氢转移。Sirt1是一个与细胞分化、衰老、凋亡和能量代谢密切相关的NAD＋依赖的组蛋白去乙酰化酶［19］。Sirt1通过连接调节NAD+补救途径的酶反馈回路和昼夜节律转录-翻译反馈回路，调节代谢及昼夜节律［20-22］。在神经退行性疾病治疗过程中，可通过补充NAD+中间产物来恢复NAD+水平，进而改善记忆退化和动作迟钝等症状。在细胞增殖和分化的过程中，NAMPT作为整个反应启动因子，最终产生Sirt1，激活下游信号通路，对细胞进行调控。据报道，在高糖和游离脂肪酸微环境中，miR-449通过抑制Sirt1途径抑制BMSCs的成骨分化［20］。NAMPT/NAD/Sirt1轴信号转导通路是调控BMSCs增殖、分化的重要通路之一［23］。NAMPT抑制剂FK866通过抑制尼克酰胺的合成，降低Sirt1活性，进而减少BMSCs的分化。本研究结果显示，NAMPT抑制剂FK866下调TSPL处理的BMSCs中NAMPT和Sirt1蛋白表达水平，且降低NAD+水平，提示NAMPT/NAD/Sirt1信号通路被阻断；经Sirt1蛋白的激活剂SRT2104处理后，Sirt1蛋白表达量增加，提示NAMPT/NAD/Sirt1信号通路可能在TSPL诱导的BMSCs向髓核样细胞分化中发挥重要作用。

综上所述，TSPL可通过激活NAMPT/NAD/Sirt1信号通路，促进BMSCs向髓核样细胞分化来改善椎间盘退变，这为TSPL治疗椎间盘退变提供了实验基础。