辣椒轻斑驳病毒研究的回顾与展望

杨中周 邓竹根 李曼 戴祖云

摘    要：近年来，辣椒生产中辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）危害日趋严重，并影响到辣椒的品质和产量。综述了辣椒轻斑驳病毒的危害性与分布、寄主范围、在寄主组织中的分布与传播途径、基因组结构、致病型及亲缘关系、检测方法、防治方法等方面的研究进展，并对存在的相关问题进行分析与展望，以期为今后的PMMoV防治与抗性品种选育提供借鉴和参考。

关键词：辣椒;辣椒轻斑驳病毒;寄主范围;抗病育种;防治方法

中图分类号：S641.3 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）09-001-06

Review and prospect of research on Pepper mild mottle virus（PMMoV）

YANG Zhongzhou1， DENG Zhugen1， LI Man1，2， DAI Zuyun1，2

（1. Anhui Jianghuai Horticulture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. College of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， Anhui， China）

Abstract： In recent years， Pepper mild mottle virus （PMMoV）has become more and more serious in pepper production， and affects peppers quality and yield. For this reason， we summarize the harmfulness， geographic distribution， host range， distribution in host tissues， transmission， genome structure， pathotype， phylogenetic relationship， detection method， prevention and control of PMMoV. The prospects and analysis of the existing problems are also discussed in order to provide reference for the control of PMMoV and breeding of resistant varieties in the future.

Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus（PMMoV）; Host range; Resistance breeding; Prevention and control

2018年我国辣（甜）椒（Capsicum spp.）常年播种面积在200万hm2，约占世界辣椒播种面积的40%，在蔬菜作物中稳居第一，成为我国蔬菜第一大产业[1-3]。病毒病是制约我国辣（甜）椒生产的一类重要病害，目前世界上报道能够感染辣椒的病毒有60余种[4-5]，我国报道的种类在30种以上，黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）仍是危害辣椒的最主要病害。但是，近些年辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）在一些地区已经成为了一种普遍发生的病害，特别是在江苏地区，其平均检出率高达62.28%[6]。在北京地区市场上销售的商品种子阳性检出率达61.11%，该病毒不但可以通过汁液摩擦传播，而且还可以通过种子传播，所以具有很大的潜在传播性[7]。近几年，国内外在PMMoV分布与寄主范围、检测方法、基因序列分析与亲缘关系研究、抗病性品种选育等方面取得诸多重要进展，笔者着重对该病毒上述方面进行了总结，提出存在的问题和发展方向，以期为今后辣椒轻斑驳病毒病的研究提供理论参考。

1 PMMoV危害性与分布

PMMoV属于帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的无包膜正单链RNA病毒，是在世界范围内造成辣椒重要经济损失的一个重要病原[8]。辣椒叶片在被侵染后或表现症状不明显，或出现褪绿斑驳和花叶症状;植株生长明显变缓，发病越早，长势受影响越大;果实被侵染后的症状较为明显，表现为果小、果面有褪绿斑驳、凹凸斑点、甚至出现畸形与坏死现象。PMMoV可随带病的辣椒进入人体，经过消化排出人体后，仍具有侵染活性[9]。PMMoV最早于1964年在美国被发现[10]，其后在西班牙、德国、澳大利亚、阿根廷、匈牙利、荷兰、加拿大、英国、保加利亚、韩国、越南、印度、巴基斯坦、塞尔维亚、意大利、土耳其、捷克、日本等国均有报道，并对一些地区的辣椒生产造成严重的经济损失[11-20]。PMMoV于1994年在我国新疆石河子地区被首次报道[21]。至今，黑龙江哈尔滨[22]、四川汶川[23]、安徽和县[24]、辽宁葫芦岛[25-26]、辽宁凤城[27]、青海海东[28]、湖南[29]、吉林九台[30]、上海奉贤[31]、贵州绥阳[8]、新疆巴州[32]、北京[33]、山东寿光[34-35]、江苏南京[36]、河北保定[37]、广西[38]、广东[39]、海南[40]、云南[41]、宁夏[42]、西藏[6]等地区已有该病毒的相关報道。

2 PMMoV的寄主范围

在自然条件下，PMMoV会侵染辣椒，因此，辣椒也首次被报道为PMMoV系统侵染的一个自然寄主。以往认为PMMoV的主要寄主包括茄科、藜科和苋科植物，会对其造成局部或系统侵染[43]。近些年，随着全国对蔬菜病毒病的调查和诊断，明确PMMoV还能自然侵染茄科的番茄，葫芦科的南瓜、黄瓜、西葫芦、甜瓜，豆科的豇豆等作物，而且在江苏葫芦科蔬菜样品中检出率为83.33%，并与其他病毒发生复合侵染的频率高且范围广。未发现PMMoV自然侵染十字花科的萝卜、青菜、大白菜、甘蓝、油菜、花椰菜、牛皮菜、芥菜、青花菜、白菜薹、菜薹和豆科菜豆、大豆的现象[6，44-45]。在中药材方面，PMMoV能够侵染延龄草科的滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis），使其出现花叶、斑驳和褪绿症状[46]。

3 PMMoV在寄主组织中的分布及传播途径

在侵染辣椒以后，PMMoV在辣椒的叶片、花瓣、花药、花粉粒、果实、种子、根系等组织中广泛分布[47]。然而，不同的组织器官间含量有差异，对同一个组织器官来说，又存在分布的不均一性。比如，叶片组织中的PMMoV含量明显高于种子中的含量;在叶肉细胞中的含量明显高于叶脉，且集中分布于叶肉细胞的栅栏组织中，其次是海绵组织，表皮组织中仅有少量分布;在种子中又主要集中在种皮，其次是胚乳靠近种皮的部分，而胚中无分布[48-49]。PMMoV虽在植物间不易介体传播，但鉴于其在植物体中的分布情况，该病毒很容易通过种传和汁液摩擦传播。带毒的种子以及被感染的植株是重要的传染源，其中种子和花粉带毒是其远距离传播的主要途径[48，50]。

4 PMMoV的基因组结构

PMMoV病毒粒体呈直杆状，基因组长6356 bp，共有4个开放阅读框（Open reading frames，ORFs），编码4个蛋白质：ORF1（70～3423 nt）编码1个全长1117 aa，分子质量为126 kDa的蛋白质（包含甲基转移酶和RNA螺旋酶区）;ORF2（70～4908 nt）编码1个全长1613 aa，分子质量为183 kDa的蛋白质（包括RNA复制酶区）;ORF3（4909～5682 nt）编码一个257 aa，分子质量约为28 kDa，与病毒移动相关的运动蛋白;ORF4（5685～6158 nt）编码1个157 aa，分子质量约为17 kDa，用于保护病毒核酸且参与侵染的外壳蛋白。ORF1阅读框终止于琥珀密码子UAG，约有10%的概率可通读ORF2。ORF1和ORF2所编码的蛋白质与病毒RNA复制以及维管束运动有关。PMMoV的3末端和烟草花叶病毒属的其他成员一样具有类似t-RNA状的二级结构[29，46，51]。

5 PMMoV的致病型及各分离物之间的亲缘关系

L1、L2、L3、L4 四个L系列等位基因是辣（甜）椒抗烟草花叶病毒属病毒的主要抗性基因[52]，根据烟草花叶病毒属病毒对四种L抗性基因的致病性可将该属病毒划分成 P0、P1、P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4五种致病基因型。目前，国际上将发现的PMMoV致病基因型分为P1，2、P1，2，3、P1，2，3，4三种，而中国大陆（辽宁、北京、山东青岛、河北保定、新疆等地）的分离物都属于P1，2致病基因型，而中国台湾的分离物属于P1，2，3致病基因型，从台湾进口的种子检测的结果也证实了这点[32， 51，53-54]。P1，2致病型病毒株系能够系统侵染带有L1、L2抗性基因的辣（甜）椒，而带有L3、L4抗性基因的辣（甜）椒对该病毒株系表现有抗性;P1，2，3致病型病毒株系能够系统侵染带有L1、L2、L3抗性基因的辣（甜）椒，带有L4抗性基因的辣（甜）椒对该病毒株系表现有抗性;P1，2，3，4致病型病毒株系能够攻克L4基因抗性。从进化关系来看，P1，2，3与P1，2，3，4分别是由P1，2和P1，2，3正向选择进化而来。

近几年，随着越来越多分离物的全基因序列在GenBank上登录，更多的基础信息为人们所知。研究者们开始对这些序列进行同源性分析和系统进化分析，以期探索各分离物之间的亲缘关系，解决更深层次的进化问题。李丽丽等[22]的研究结果显示，PMMoV中国分离物Hrb与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组序列的同源性为94.0%～99.6%;基于辣椒轻斑驳病毒基因组运动蛋白及外壳蛋白序列的系统进化分析结果显示，Hrb与日本分离物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）亲缘关系较近;与西班牙分离物PMMoV-Ia亲缘关系较远。杨林毅等[46]将中国云南曲靖分离物PMMoV-QJ与10个PMMoV分离物基因全序列进行比对分析，结果显示同源性为99.42%～99.81%，同源性较高;PMMoV-QJ与中国辽宁葫芦岛分离物PMMoV-Huludao、2个韩国分离物PMMoV-LS和PMMoV-RP的亲缘关系较近。韩帅等[23]的研究结果显示，中国四川汶川分离物PMMoV-WC与中国北京分离物PMMoV-CN亲缘关系较近，而与西班牙分离物PMMoV-Ia亲缘关系较远。严丹侃等[24]将安徽和县的分离物PMMoV-AH与12个国内外PMMoV分离物的外壳蛋白基因序列进行系统发育分析，发现PMMoV-AH与包括PMMoV-CN在内的9份亚洲分离物的亲缘关系较近，而与西班牙分离物PMMoV-Ia、意大利分离物PMMoV-I和以色列分离物PMMoV-Is亲缘关系较远。刘湘宁等[29]通過一致性分析发现，湖南辣椒分离物PMMoV-HN1与17种PMMoV病毒分离物的一致性在94.2%～99.7%之间;系统进化分析显示PMMoV-HN1与PMMoV-CN的亲缘关系最近，与PMMoV-Ia和韩国分离物PMMoV-P3亲缘关系较远。竹怀婷等[27]的研究表明，辽宁凤城分离物的 PMMoV-FC与9个PMMoV分离物序列同源性为94.4%～99.7%，同源性很高;PMMoV-FC与6个来自中国、日本、韩国和美洲的分离物亲缘关系较近，而与PMMoV-Ia和PMMoV-P3相对较远。李晓冬等[26]分析了辽宁分离物PMMoV-LN与13个国内外PMMoV分离物的同源性，结果显示其同源性为94%～100%，系统进化分析表明PMMoV-LN和10份来自于亚洲的分离物亲缘关系密切;且与国内分离物具有相同的进化祖先，而与PMMoV-I、PMMoV-Is、PMMoV-Ia亲缘关系较远。王少立等[34]认为，中国山东分离物SD60与中国贵州分离物KC571248的相似性最高且亲缘关系最近，而与以色列分离物EF422083、土耳其分离物HE963028和西班牙分离物HG514455等亲缘关系较远。总体而言，中国分离物之间普遍存在较高的同源性，且与许多亚洲、美洲分离物之间的亲缘关系较近，而与西班牙、意大利、以色列的分离物之间的亲缘关系较远。

6 PMMoV的检测方法

国内外对PMMoV检测的方法有生物学方法、电镜技术、血清学测定法（酶联免疫吸附测定）和以核酸为基础的分子生物学测定法（RT-PCR和实时荧光RT-PCR法）。目前以酶联免疫吸附测定法（ELISA）和RT-PCR法最为常用。

通过鉴定寄主反应与范围、交叉保护反应和传毒方式进行植物病毒病诊断的生物学方法是植物病毒检测的传统技术。该技术是其他方法的重要基础，具有直观的特点，曾被广泛应用[21]，然而该技术具有需要隔离温室、种植大量鉴别寄主、检测样品数量有限、耗时长、受环境和季节影响较大等劣势，已经无法满足当前大批量的快速诊断和田间检测需求。

结合超薄切片、负染色和血清学电镜技术可直观地观察病毒粒體的形态结构和寄主细胞的结构变化[21]，特别是结合血清学技术之后，电镜技术更加灵敏，成为植物病毒研究的一个重要手段。然而该项技术需要人员具有较强的专业知识背景，且设备昂贵，在实际检测中使用频率也相较ELISA和RT-PCR低，因此在实际大批量病毒检测中运用较少。

采用固相吸附，将免疫反应和酶高效催化反应有机结合的ELISA具有操作简单、检测时间短、灵敏性高、特异性强等特点，目前在蔬菜种苗的PMMoV检测中发挥重要作用[8，27，32，46，54]。在野外工作中，也可使用PMMoV胶体金免疫层析试纸条对样本进行快速检测[24]。

RT-PCR是以PCR为基础的衍生技术，该项技术相较ELISA具有更高的灵敏度[7]、更强的特异性，同时可以突破血清学方法的局限，能够鉴定同种病毒的不同株系。目前该项技术已被大量地运用到PMMoV检测中[22-28，30-32，43，46，54]。郭京泽等[55]所建立PMMoV实时荧光PCR检测方法灵敏度是DAS-ELISA法的100倍，且检测简便、快速，能够很好地满足种苗快速诊断和进出口检验检疫需求。

7 PMMoV的防治方法

PMMoV具有种传特性，带毒种子是病毒长距离传播的重要途径。另外PMMoV可随辣椒制品进入人体体内，经消化排出后，仍具有侵染活性[9，56]。鉴于此，加强种子及辣椒制品的检疫是防治其快速蔓延的重要途径。开展抗病育种是防治该病毒的最有效方式之一。L系列等位基因（L1、L2、L3、L4）是抗烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的主要抗性基因[52]。L3和L4基因对国内的PMMoV致病型P1，2具有抗性，已在国内外辣（甜）椒抗烟草花叶病毒属育种上得到应用。Hiroshi等[57]发现WA31-1500S与L4紧密连锁，遗传距离在1.5 cM以内，该标记可以用于抗性资源的筛选。张宝玺等[41，58-59]构建了与L3、L4等抗性性状紧密连锁的分子标记，并通过回交转育结合分子标记辅助选择，选育出含有L3抗性的甜椒品种，并将L4基因也转育到多份自交系材料中，以期望解决商业种植中的抗病问题。

此外，常规种子及土壤消毒处理也是有效的保护措施。随着溴甲烷（MeBr）用于包括PMMoV在内的土传病毒病熏蒸消毒的方法被禁止，一些新的方法被挖掘出来。如Jarret等[60]的研究表明，用10%磷酸三钠（TSP），室温下处理PMMoV感染的辣椒种子2.5 h，可以钝化病毒;用10%TSP处理24 h，可使2/3的供试材料去除PMMoV。由于PMMoV能侵染藜科、苋科植物，而在藜科和苋科植物中，多数成员都是田间杂草，故而很可能田间杂草上也存在着PMMoV。因此对田间杂草连同田间感病作物进行清理、消毒显得尤为重要。Aguilar等[61]的研究显示，在西班牙东南部，堆肥中的高温范围在61.9～73.8 ℃，长时间的高温使得病毒和真菌不能存活，使用PMMoV感染的植物残体作为有机改良剂的堆肥似乎没有将病原体重新引入土壤的风险，适合通过堆肥从被感染的作物残体中充分清除PMMoV病原体。

除以上方法，也可以通过农事操作中的一些措施来减少PMMoV感染的概率。巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和皮氏罗尔斯通氏菌（Ralstonia pickettii）的混悬液浸根能有效地抑制土传PMMoV病害[62]。食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）菌株KBPF-004对烟草病毒的机械传播具有抗病毒活性[63]。Oka等[64]发现，商业纤维素酶对植物PMMoV感染有很强的抑制作用。用纤维素酶溶液对甜椒叶片进行预处理，可大大减少PMMoV感染植株的数量。注重对农事操作的机械器具的消毒，适当减少移栽时的根部受损和采收时的植株受伤，能够明显降低病毒传播概率[65]。Rie等[66]利用减毒PMMoV分离物的交叉保护作用，提高已接种辣椒植株的抗性，获得了较好的经济效益。

8 问题与展望

随着种子贸易和种质资源交流的日益频繁，PMMoV已经成为一个世界性病害，严重威胁着辣椒的生产。在国内，其分布范围也在逐年扩大，在一些地区已上升为主要病毒种类;相关寄主越来越多的被报道出来。之前认为不会被感染的一些作物，现在也成为了它的寄主，如番茄和葫芦科的南瓜、西葫芦、黄瓜、甜瓜等。目前中国大陆的致病型是P1，2，而从中国台湾进口的种子里检测到的致病型是P1，2，3，GenBank中更能查询到西班牙、意大利、以色列的P1，2，3致病型和以色列的P1，2，3，4致病型。鉴于此，应加强种苗的检测与检疫工作，将PMMoV作为检疫对象，列入《进境植物检疫性有害生物名录》，控制好侵染源头，避免致病性更强的病毒扩散、蔓延。

目前，对于病毒病最常用的种子消毒方法是磷酸三钠（TSP）法，然而用TSP处理种子，只能钝化病毒，不能消除病毒的侵染性。长时间的TSP处理虽可使部分种子去除PMMoV，却降低了辣椒种子的发芽率，显著增加异常苗数量[60]。当前急需一套既能有效消除PMMoV侵染能力又不至于明显降低种子发芽势和发芽率的消毒方法，为种子的长距离调运保驾护航。

选育抗病品种无疑是最为高效经济、绿色环保、便于推广的对抗病毒病的手段。近些年，无论是国外还是国内，辣椒抗PMMoV的研究从病害检测、资源引进、标记开发、新品种选育都有了长足发展。育种家通过轮回选择和分子标记辅助选择培育出一批含有L3抗性基因的商业品种。L3抗性基因虽然对P1，2致病型有抗性，但因有抗性基因的压力，P1，2致病型会发生基因突变，攻克L3抗性，使得原先的抗病品种重新感病。接着育种家会选择利用抗性更强的L4抗性基因选育新品种，如此交替进行。如何使品种获得持久的抗病性是需要育种家认真考虑的问题。一方面需要寻找、鉴定出有别于L系列等位基因的新抗源，拓宽遗传背景，并加以利用;另一方面可以将更多不同背景的抗性基因聚到一个品种中，使得病原株系很难通过一个位点的突变而攻克品种抗性。

近些年，隨着国内外越来越多的PMMoV分离物的基因组全序列被公布，开展分子变异特点等基础性的研究工作，可为今后研究病毒扩散和有效防控提供理论指导。

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