鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

张玉杰，刘红祥，刘 东，张 翔，杜元钊

（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114）

鸭源鸡杆菌（Gallibacterium anatis）作为巴氏杆菌科鸡杆菌属的一个代表种[1]，常引起开产蛋鸡输卵管炎、输卵管囊肿和败血症等生殖系统疾病[2]，导致产蛋量和蛋品质下降。临床上，青年鸡感染该菌后无明显临床表现，不易被察觉，直到鸡群开产后，由于各种应激因素刺激，感染鸡群常突然发病，造成极大经济损失。

20 世纪90 年代，我国北方地区开产后的蛋种鸡或肉种鸡在经3～5 轮人工授精后，出现严重的产蛋下降或孵化率降低现象，但对其病因长时间内未有明确定论。直到2019 年初，张玉杰等[3]对我国人工授精后的蛋种鸡或肉种鸡产蛋下降问题进行了系统研究，并证实该病病原是鸭源鸡杆菌。临床上，该细菌与新城疫病毒（非典型新城疫）、鸡传染性支气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽腺病毒EDS-76 等[4]引起的临床症状相似，不易区分，临床鉴别诊断较为困难，需要进行实验室检测。

目前，鸭源鸡杆菌的检测方法主要有细菌分离鉴定、ELISA、PCR、乳胶凝集试验等[5-6]，而平板凝集试验鲜有报道。本研究将已分离鉴定的鸭源鸡杆菌YT-1 株制备成平板凝集抗原，初步建立了该菌的平板凝集检测方法，并应用该方法对全国不同地区鸡场采集的鸡血清样品进行了鸭源鸡杆菌血清抗体检测。

1 材料与方法

1.1 材料

鸭源鸡杆菌YT-1 株，由青岛易邦生物工程有限公司技术服务部检测中心，自山东省烟台市人工授精后产蛋下降的蛋种鸡输卵管内分离鉴定并保存。鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、鸡巴氏杆菌、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽腺病毒等病原的阳性血清，购自中国兽医药品监察所；鸡临床血清样品436 份，采集自2020 年以来全国不同地区150～200 日龄的开产母鸡；健康家兔（体质量约2 kg），购自北京维通利华实验动物中心；LB 培养基、TSA 培养基、TSB 培养基，购自美国BD 公司；绵羊血平板培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；马血清，购自HyClone 公司。

1.2 方法

1.2.1 鸭源鸡杆菌复苏和扩大培养 从-80 ℃低温冰箱中取出冻存管，于37 ℃水浴中解冻，用接种环将其划线接种在绵羊血平板上，37 ℃培养24 h；按照文献[5]的方法，对复苏菌落进行鉴定；将鉴定好的菌落接种于绵羊血平板复壮，连续传3代后用于抗原制备；挑取绵羊血平板上的单菌落接种于含5%马血清的TSB 培养基中，200 r/min 振荡培养8 h，按照体积比1:100 接种于100 mL 新鲜TSB 培养液中，振荡培养12 h 后进行平板计数。

1.2.2 细菌灭活及检验 向菌液中加入0.2%的甲醛，37 ℃ 150 r/min 作用24 h 灭活细菌；将以上菌液4 000 r/min 离心5 min，弃掉上清液，用0.5%石炭酸生理盐水洗涤菌泥3 遍，收集菌泥，再用0.5%石炭酸生理盐水10 mL 重悬菌泥；取灭活后的菌液100 μL 涂布于绵羊血平板上，37 ℃培养24 h（此时应无细菌生长）。

1.2.3 阳性和阴性血清制备 将制备好的鸭源鸡杆菌抗原与白油佐剂按照体积比2:3 混合，乳化后皮下多点注射免疫健康家兔，1 mL/次（1010CFU），每隔7 d 免疫1 次，连续免疫3 次；三免后14 d，无菌心脏采血，分离血清分装作为阳性血清；采集对照组健康家兔血清并分装，作为阴性血清。以上血清-20 ℃保存备用。

1.2.4 平板凝集试验检测方法建立 分别取30 μL 的阳性血清、阴性血清、抗原液和稀释液至一张干净的载玻片上，再用移液器各取30 μL 鸭源鸡杆菌抗原液至载玻片上，分别与阳性血清、阴性血清、抗原液和稀释液充分混匀，室温静置3 min后观察。

1.2.5 抗原浓度调节及染色 将已知浓度的灭活菌液用0.5%石炭酸生理盐水稀释，调整其浓度为9×109、7×109、5×109、3×109和1×109CFU/mL 5 个梯度，然后用不同浓度的菌悬液与兔抗鸭源鸡杆菌阳性血清进行玻片凝集试验，出现100%凝集现象的次高菌液稀释度确定为鸭源鸡杆菌抗原的最佳工作浓度。将该稀释度菌液用石炭酸复红染色，离心收集菌液，加入石炭酸复红染色液至最佳工作浓度，充分摇匀，4 ℃冰箱保存备用。

1.2.6 特异性试验 用鸭源鸡杆菌染色抗原，分别与该菌的鸡源阳性血清、分离自健康鸡的阴性血清，以及鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽腺病毒等病原的阳性血清进行凝集试验，检测其特异性，同时设立兔血清阳性对照、阴性对照和稀释液对照。

1.2.7 临床样品检测 用本试验建立的鸭源鸡杆菌平板凝集试验方法，对采集的460 份开产母鸡血清进行检测，并结合病原分离结果初步判断鸭源鸡杆菌感染情况。

2 结果

2.1 平板凝集试验

试验结果（图1）显示：兔抗阳性血清与鸭源鸡杆菌抗原液混合后发生100%凝集，而阴性血清、鸭源鸡杆菌抗原液和0.5%石炭酸生理盐水稀释液与鸭源鸡杆菌抗原液混合后均不凝集。

图1 鸭源鸡杆菌染色抗原凝集试验结果

2.2 抗原最佳工作浓度

将5 个浓度梯度的抗原液分别与兔抗鸭源鸡杆菌阳性血清进行玻片凝集试验。结果（表1）显示：当抗原浓度为5×109CFU/mL 时，抗原与血清凝集最佳，体系充分反应，液体透明，凝集颗粒均匀分布于液滴表面，由此确定抗原的最佳工作浓度为5×109CFU/mL。

表1 鸭源鸡杆菌抗原最佳工作浓度

2.3 抗原特异性检测

特异性检测结果（图2）显示，石炭酸复红染色液染色的抗原与鸡源阳性血清产生明显凝集，而与鸡源阴性血清以及鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽腺病毒等病原的阳性血清均不凝集。

图2 鸭源鸡杆菌染色抗原凝集试验结果

2.4 临床样品检测

对来自全国不同地区的460 份临床血清样品，采用建立的平板凝集试验方法进行检测。结果（表2）显示：①各地区鸭源鸡杆菌血清抗体的阳性率从0～100%各不相同，不同品种鸡均有感染。②蛋鸡和蛋种鸡阳性率大多高于白羽肉种鸡，大部分人工授精的蛋种鸡和肉种鸡阳性率高达100%。③一些笼养种鸡，在3～5 轮人工授精之后表现出明显的产蛋率或受精率下降现象，其中白羽肉种鸡主要表现为受精率下降，而蛋种鸡主要表现为产蛋率下降。④开产后“假母鸡”无产蛋高峰，且存在输卵管不发育或充盈透明液体现象。⑤人工授精的蛋种鸡和肉种鸡鸭源鸡杆菌血清抗体阳性率与鸭源鸡杆菌分离率完全一致，“假母鸡”鸭源鸡杆菌血清抗体阳性率略低于鸭源鸡杆菌分离率。

表2 各地区鸡场鸭源鸡杆菌血清抗体检测结果

3 讨论

目前临床上主要用PCR 和病原分离的方法进行鸭源鸡杆菌的病原学诊断[7-8]，用ELISA 方法进行血清学检测[6]。以上方法虽然特异性强、准确性高，但细菌培养需要的营养条件比较苛刻，成本较高且不易操作，难以在基层养禽场推广应用。本研究建立的平板凝集试验方法对试验环境要求不高，但结果准确、操作简便快捷、易掌握、成本低，可用于快速诊断，适合于基层养殖场使用，亦可辅助实验室开展大规模血清学流行病学调查。本研究选用鸭源鸡杆菌YT-1 株作为抗原，能特异性地针对该菌引起的产蛋下降现象进行血清学诊断，制备的抗原能特异性检测出鸭源鸡杆菌阳性血清，可用于不同地区鸡群的鸭源鸡杆菌流行病学调查。

对比不同鸡群的鸭源鸡杆菌平板凝集检测结果与病原分离结果，发现两种检测方法下人工授精的蛋种鸡和白羽肉种鸡检测结果完全一致，“假母鸡”的平板凝集检测结果略低于病原分离结果。在实际生产中，动物机体往往在感染病原一定时间后，血清抗体才会转阳，因此平板凝集试验的结果要比病原分离的结果稍滞后[9]，但整体上并不影响结果判断的准确性。本研究表明，不同检测方法的检测结果有一定差异，因此应根据研究目的选择合适的检测方法。对于临床诊断高度疑似病例，经平板凝集检测为阴性的应采取病原分离展开进一步检测，以提高临床诊断率，避免出现漏诊与误诊现象。

本研究对来自全国不同地区的460 份血清进行了鸭源鸡杆菌血清流行病学筛查，初步了解了我国鸡群中鸭源鸡杆菌的流行情况，为后续加强对该病的综合防控提供了依据。在被调查的14 个鸡场中，有12 个鸡场为鸭源鸡杆菌抗体阳性场，说明鸭源鸡杆菌感染在鸡群中比较普遍，这与李乔晶等[10]的研究结果一致。不同品种蛋鸡血清鸭源鸡杆菌抗体阳性率为18.2%～42.0%，而非人工授精白羽肉种鸡鸭源鸡杆菌阳性率均在5%以内，造成这种差异的原因可能是白羽肉种鸡较蛋鸡的饲养管理水平和生物安全水平高，这与Bojesen 等[11]、Lozica 等[12]对丹麦不同饲养方式健康产蛋鸡的调查结果相似。在一些无产蛋高峰鸡群的输卵管内分离到一定量的鸭源鸡杆菌，且这些鸡的输卵管不发育或发育不完全（假母鸡），这与Nassik 等[13]、王川庆等[14]的研究结果一致，表明该菌影响的靶器官主要是生殖系统，并可能参与了鸡传染性支气管炎病毒对雏鸡早期生殖系统的损伤过程。前期国内外研究多认为，该病原菌主要与蛋鸡产蛋下降有关[15-16]，而缺少对种鸡所产种蛋受精率的研究和报道。本研究通过血清学诊断技术揭示了该病原菌在种鸡上的危害，与实验室的前期研究结果相一致[3]。种鸡人工授精技术是提高公鸡利用率和母鸡受精率，减少养殖成本，提高养鸡效益的重要途径。该检测技术是现代种鸡生产中极为重要的技术支撑，但应注意采精和授精过程中的无菌操作以及种公鸡是否携带致病原等，综合做好鸡群的健康管理是应用该技术的重要前提。国外考虑到动物福利等因素，不施行人工授精技术，因此鲜有该病在种鸡上的报道。