基于p30-gp90 融合蛋白的禽网状内皮组织增生症病毒抗体间接ELISA 方法的建立

栾晓宁，郭龙宗，马广斌，李玉燕，王一新，巩新民

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2.山东益生种畜禽股份有限公司，山东烟台 265509；3.山东信得科技股份有限公司，山东青岛 266071）

禽网状内皮组织增生症（reticuloendotheliosis，RE）是由逆转录病毒科禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus，REV）引起鸡、鸭、火鸡和其他禽类的一种以淋巴-网状细胞增生为特征的肿瘤性病理综合征。REV 不但可以引起禽发生肿瘤，更重要的是，还会引起禽的免疫抑制，干扰其他禽病疫苗免疫效果，导致免疫失败，从而继发其他病毒混合感染，造成严重经济损失[1-2]。尽管不同毒株致病性存在差异，但目前所有REV 分离株都具有相似的抗原特性。REV 既可以水平传播，也可以通过胚胎垂直传播。此外，使用携带REV 的SPF 鸡胚生产禽用弱毒疫苗，会造成疫苗污染，这是REV 独特的传播途径之一。在我国，使用被REV 污染的弱毒疫苗被认为是造成REV 流行的一个重要原因[3-5]。

REV 呈世界性分布。流行病学调查[6-8]发现REV 感染在我国鸡群特别是地方品系鸡群中相当普遍。目前没有商品化疫苗和药物可用于RE 防治，主要依靠淘汰阳性种群实现禽群净化。因此，对该病进行早期检测非常重要。目前已有很多方法应用于REV 检测，如间接免疫荧光（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等[9-11]。其中，IFA 需要分离、培养病毒，操作过程繁琐；进口ELISA 试剂盒价格昂贵，成本较高。因此，开发一种简单快速、成本低廉的诊断方法对于监测REV 感染十分必要。

REV gp90 蛋白是一种重要的免疫原性蛋白，在免疫应答、诱导中和抗体中起着重要作用[12]。由gag基因编码的p30 蛋白是REV 主要的群特异性抗原，在病毒粒子的装配中发挥着重要作用，其氨基酸组成相对保守[13]。本试验将编码REV 群特异性抗原的p30基因和编码囊膜糖蛋白的gp90基因通过3×GGGS linker 串联，在大肠杆菌中成功实现了串联基因的表达。随后，本试验以p30-gp90 融合蛋白为包被抗原，建立了检测REV 抗体的间接ELISA 方法，从而为RE 的诊断和检测提供了一种良好的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌株和载体

大肠杆菌DH5α 感受态细胞、BL21（DE3）感受态细胞，购自北京全式金生物技术有限公司；原核表达载体pET-32a（+），由本实验室保存。

1.2 主要试剂

T4 DNA 连接酶、EcoRⅠ和SalⅠ限制性内切酶，购自宝生物工程（大连）有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），购自Solarbio公司；病毒DNA 提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒和DNA 片段纯化回收试剂盒，购自北京诺贝莱生物科技有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒和Ni 琼脂糖凝胶，购自北京碧云天生物技术公司；SDSPAGE 凝胶制备试剂盒、预染蛋白质分子质量标准，购自上海雅酶生物医药科技有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鸡IgY 抗体，购自Sigma 公司；鸡抗REV 单因子血清，由本实验室制备，即将REV SNV 株接种2 周龄SPF 鸡，感染2 周后采血分离血清，经ELISA 试剂盒（IDEXX公司生产）检测阳性者保存备用。A 亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B 亚群禽白血病病毒（ALV-B）、J 亚群禽白血病病毒（ALV-J）、鸡马立克氏病病毒（MDV）、鸡传染性贫血病毒（CAV）和鸡呼肠孤病毒（REO）阳性血清，由本实验室将相应毒株接种SPF 鸡制备；鸡新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）和鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）阳性血清，由本实验室将相应商业化疫苗接种SPF 鸡制备。

1.3 p30-gp90 融合基因扩增

使用Primer Premier 5.0 软件设计引物（表1）。其中在p30-F 引物序列中添加EcoRⅠ酶切位点，在gp90-R 引物序列中添加SalⅠ酶切位点，在p30-R 和gp90-F 引物序列中添加3×GGGS linker序列。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。以REV SNV 株（GenBank 登录号：DQ003591）基因组RNA 为模板，通过RT-PCR 分别扩增p30和gp90基因序列。随后，以p30-F 和gp90-R 为引物，以p30和gp90基因扩增产物为模板，通过融合PCR 将两者串联，并连接到pMD-18T 载体，所构建质粒命名为pMD-p30-gp90。

表1 试验所用引物序列

1.4 p30-gp90 原核表达质粒构建与鉴定

同时使用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ，酶切pMD-p30-gp90 质粒和pET-32a（+）载体，再将p30-gp90 胶回收片段和pET-32a（+）载体16 ℃连接4 h；连接产物转化至DH5α 感受态细胞，挑取单菌落进行菌液PCR 鉴定，提取质粒并送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。将所构建的原核表达质粒命名为pET-p30-gp90。

1.5 p30-gp90 融合蛋白诱导表达及可溶性分析

将pET-p30-gp90 原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的琼脂板，筛选阳性重组菌；取0.5 mL 重组菌液加入到50 mL LB 培养基中，置于200 r/min，37 ℃摇床中培养至菌液OD600值达到0.5 左右，再加入IPTG 至终浓度1 mmol/L，28 ℃诱导6 h；将菌液4 000 r/min 离心10 min，弃上清，利用5 mL PBS 重悬菌体，超声破碎菌体（300 W，破碎3 s，间歇3 s，100 次）；对超声破碎后的菌体12 000 r/min，4 ℃离心10 min，分别收集上清和沉淀（包涵体），并使用8 mol/L 尿素溶解包涵体；将上清和包涵体进行SDS-PAGE 电泳，并通过考马斯亮蓝染色分析。

1.6 p30-gp90 融合蛋白纯化及鉴定

取5 mL 重组菌液加至500 mL LB 培养基中进行诱导表达。收集包涵体沉淀，以Ni-琼脂糖凝胶为基质进行蛋白纯化，操作步骤参照碧云天生物技术有限公司的His 标签蛋白纯化试剂盒说明书进行。通过Western blot 对纯化后的蛋白进行鉴定，将纯化后的p30-gp90 蛋白经12% SDS-PAGE 电泳后，转至PVDF 膜上，并以5%的脱脂奶粉-PBST溶液室温下封闭1 h，以PBST 洗涤3 次，每次10 min；加入鸡抗REV 单因子血清，4 ℃孵育过夜，再以相同方法洗涤3 次，加入HRP 标记的山羊抗鸡IgY 抗体，37 ℃孵育1 h，以同样方法洗涤后加入ECL 发光液显色。

1.7 间接ELISA 检测方法建立

采用棋盘法，以0.05 mol/L 碳酸盐缓冲液（pH9.6）为稀释液，将纯化后的p30-gp90 蛋白分别稀释至0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL，各取100 μL 加入反应板，4 ℃包被过夜；用0.5%PBST 洗涤3 次，每次5 min，每孔加入300 μL 5%脱脂乳溶液于37 ℃封闭2 h；随后，每孔按1:200稀释度加入100 μL 阴性、阳性血清，37 ℃孵育1 h；洗涤3 次，每孔加入100 μL HRP 标记的山羊抗鸡IgY 抗体，37 ℃孵育1 h；洗涤3 次，每孔加入100 μL TMB 显色液反应10 min；最后，每孔加入50 μL 2 mol/L 的H2SO4终止显色，使用酶标仪检测OD450值。根据OD450结果计算P/N值，选择P/N最大时的条件作为抗原最佳包被浓度。

1.8 最佳反应条件摸索

以1.7 确定的最适抗原包被浓度包被p30-gp90蛋白，洗板后加入5%脱脂乳封闭液封闭2 h；随后，分别将阴性和阳性血清进行1:200、1:400、1:600 和1:800 稀释，37 ℃孵育一抗1 h，其余操作同步骤1.7；使用酶标仪检测OD450值后，选择P/N最大时的条件作为检测血清的最佳稀释倍数。同理，摸索最佳二抗稀释度、最适血清和二抗孵育时间、最佳显色时间和最佳封闭条件。其中，二抗分别进行1:3 000、1:5 000 和1:8 000 稀释，血清和二抗孵育时间设为30、45、60 min，显色时间分别设为5、10、15 和20 min，封闭条件使用5%脱脂奶粉分别封闭1、2、3 和4 h。最后，经酶标仪测定OD450后，当P/N值最大时，作为最佳反应条件。

1.9 临界值确定

采集150 份SPF 鸡血清，根据已确定的最佳反应条件进行p30-gp90 间接ELISA 方法检测，经酶标仪测定吸光值后，计算150 份样品OD450平均值（χ）及标准差（s），根据统计学原理，以χ＋3s作为临界值。当样品OD450≥χ＋3s时判定为REV 抗体阳性，OD450＜χ+3s时判定样品为阴性。

1.10 特异性测定

分别选择ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV、CAV、REO、NDV、AIV、IBV、IBDV 和ILTV 阳性血清，应用建立的p30-gp90 间接ELISA 检测方法进行测定，每份血清重复检测3 孔，检测所建立方法的特异性。

1.11 灵敏度测定

将REV 抗体阳性血清进行1:100～1:102 400的两倍倍比稀释，分别使用本试验建立的间接ELISA、IFA 和IDEXX REV 抗体检测试剂盒进行检测，每份血清重复检测3 孔，检测所建立方法的灵敏度。

1.12 重复性测定

分别从同批次及不同批次酶标板中各选择3 组，通过本试验建立的ELISA 检测方法随机抽5 份阳性样品和5 份阴性样品进行检测，每份样品3 个重复。经酶标仪测定吸光值后，计算每份样品及s，算出每份样品的变异系数（CV），

1.13 临床样本检测

将在山东省5 个不同商品代蛋鸡场采集的690份临床血清样品，通过本试验建立的方法和IFA 方法进行检测，计算两种方法的阳性率和符合率。

2 结果

2.1 目的基因扩增

利用融合PCR 技术，将REVp30和gp90基因片段通过3×GGGS 标签串联到一起。结果（图1）显示，融合基因PCR 扩增产物长度为1 968 bp，与预期片段大小相符。

图1 p30-gp90 融合基因PCR 扩增结果

2.2 p30-gp90 融合基因重组质粒构建与鉴定

将构建的重组质粒进行EcoRⅠ/SalⅠ双酶切，结果出现两条带，大小约为5 900和2 000 bp（图2）。将阳性质粒送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，然后与REV SNV 株基因序列进行比对，未发现有突变。将所构建的融合基因重组质粒命名为pET-p30-gp90。

图2 pET-p30-gp90 原核表达质粒双酶切验证结果

2.3 p30-gp90 融合蛋白诱导表达及可溶性分析

将pET-p30-gp90 质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，取阳性重组菌进行诱导表达，分别分离包涵体和上清进行SDS-PAGE 鉴定。结果（图3）显示，p30-gp90 融合蛋白成功表达，相对分子质量大小为90.2 kDa，且p30-gp90 融合蛋白主要以包涵体形式表达。

图3 p30-gp90 融合蛋白诱导表达结果

2.4 p30-gp90 融合蛋白纯化鉴定

对p30-gp90 包涵体蛋白通过Ni 琼脂糖凝胶纯化，取纯化后的融合蛋白，以鸡抗REV 单因子血清为一抗进行Western blot 鉴定。结果显示，在90.2 kDa 处出现特异性条带（图4），表明重组蛋白获得了正确表达且能够被鸡源抗体所识别。

图4 p30-gp90 融合蛋白Western blot 检测结果

2.5 间接ELISA 最佳反应条件确定

通过方阵试验对间接ELISA 反应条件进行优化。结果（表2）显示：当重组蛋白抗原量为100 ng/孔（抗原质量浓度为1 μg/mL）时，阳性血清OD450与阴性血清OD450的P/N值最高。因此确定抗原最佳包被浓度为100 ng/孔。按上述条件继续进行后续条件筛选，根据P/N值进一步明确最佳一抗稀释倍数为1:600，一抗孵育时间为30 min，酶标二抗稀释倍数为1:5 000，酶标二抗孵育时间为30 min，底物显色为室温放置15 min，封闭条件为5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。

表2 棋盘法确定最佳包被抗原浓度及血清一抗稀释度

2.6 间接ELISA 临界值确定

在已确定的最佳反应条件下，对150 份阴性血清进行测定。经计算，其χ=0.099 1，s=0.021 9。故间接ELISA 临界值确定为0.099 1 ＋3×0.021 9=0.165，当OD450≥0.165 时判定为阳性，OD450＜0.165 时即判定为阴性。

2.7 特异性检验

应用本试验建立的间接ELISA 检测方法对常见禽病原抗体进行检测。结果显示，该方法对ALV-A、ALV-B、ALV-J、MDV、CIAV、ARV、NDV、AIV、IBDV、IBV 和ILTV 的OD450平 均值 分 别 为0.086、0.081、0.094、0.117、0.064、0.113、0.058、0.074、0.104、0.054 和0.074，表明该方法无交叉特异性反应。

2.8 灵敏度检验

将REV 抗体阳性血清从1:100～1:102 400 进行倍比稀释，同时使用本试验建立的ELISA 方法、商品化REV 抗体检测试剂盒和IFA 进行测定。结果显示，本试验所建立的ELISA 方法最低检测限为1:51 200（图5），商品化REV 抗体检测试剂盒的最低检测限为1:25 600（图6），而IFA 的最低检测限为1:6 400（未附图片）。因此，本试验所建立ELISA 方法的灵敏度是商品化REV 抗体ELISA 检测试剂盒的2 倍，IFA 方法的8 倍。

图5 本试验所建立的间接ELISA对不同稀释倍数阳性血清的检测结果

图6 商品化ELISA 试剂盒对不同稀释倍数阳性血清的检测结果

2.9 重复性检验

选取200 份鸡血清样品，利用本试验所建立的间接ELISA 方法进行批内和批间重复性检测。结果显示：批内变异系数为2.6%～5.4%，平均值为3.4%；批间变异系数为1.7%～3.8%，平均值为2.4%。这表明建立的间接ELISA 方法变异程度低，重复性好。

2.10 临床样品检测

采用本试验建立的间接ELISA 方法和IFA 对采自山东省商品代鸡场的690 份血清样品进行检测。结果（表3）显示，在690 份检测样品中，本试验建立的间接ELISA 方法检出144 份阳性样品（阳性率20.87%），其中123 份为IFA 阳性，其余546 份样品经间接ELISA 和IFA 检测均为阴性，两种检测方法的符合率为96.96%（669/690）。

表3 使用间接ELISA 和IFA 检测临床样品中REV 抗体的结果对比 单位：份

3 讨论

RE 是一种重要的致肿瘤性疾病。虽然由REV单独感染引起的死亡率不高，但REV 可以造成感染禽瘦小，生长迟缓，并诱发严重的免疫抑制，从而给养禽业带来巨大经济损失。目前，REV 感染在世界范围内已非常普遍。本实验室之前的流行病学调查[6]显示，REV 在我国流行越来越严重，特别是在地方品系鸡群中，REV 血清抗体阳性率逐年升高。使用被REV 污染的弱毒疫苗被认为是导致我国REV 流行的一个重要因素[3-5]。目前，尚无针对RE 切实可行的治疗措施，也没有商品化疫苗可以使用。由于REV 可以通过垂直方式传播，目前主要通过不断淘汰感染种群以达到净化目的。因此，建立一个灵敏度高、特异性强的免疫学检测方法对于RE 的诊断和监测具有重要意义。ELISA 方法因操作简单、快速，敏感性高、特异性强，实验设备要求简单等而被广泛应用于兽医临床血清学检测。国外REV 抗体ELISA 检测试剂盒已商业化生产，但昂贵的价格限制了其在国内的大规模使用。

REV 属于正反转录病毒科γ 反转录病毒属，其基因组是单股正链RNA，编码gag、pol和env3个结构基因以及两端的长末端重复序列。gag基因编码1 个多聚蛋白，该蛋白被酶切为5 个结构蛋白，即p12、pp18、pp20、p30 和pp10。P30 是REV的群特异性抗原，在病毒组装中起重要作用[13]。由于p30 序列相对保守，因此该蛋白可用于REV抗体监测。与p30基因相比，env基因在不同毒株中差异较大[14]。REVenv基因编码病毒囊膜糖蛋白，该蛋白由gp90（surface protein，SU）和gp20（transmembrane protein，TM）组成。gp90 蛋白含有顺序和构象抗原表位，是REV 的保护性抗原，能够激发感染宿主产生中和抗体[15]。在病毒-宿主相互作用过程中，gp90 与细胞受体结合，引起gp20 构象改变，介导REV 入胞。在真核系统中表达gp90 蛋白所制备的亚单位疫苗，可有效保护宿主免受REV 感染。

由于gp90 是REV 的主要免疫保护性抗原，能够诱发机体产生高水平抗体，因此有研究[16-17]建立了基于gp90 蛋白的REV 抗体ELISA 检测方法。但与商业化试剂盒相比，基于gp90 蛋白的ELISA 检测方法灵敏度仍然不足[17]。考虑到p30是REV 的群特异性抗原，理论上基于p30 的检测方法能提高检测的特异性。因此，本试验尝试将REV 的群特异性抗原p30 和主要免疫保护性抗原gp90 融合表达，并将其作为间接ELISA 方法的包被抗原，以期提高其灵敏度和特异性。Western blot结果显示，鸡REV 单因子血清能够识别大肠杆菌表达的重组p30-gp90 融合蛋白，证实该重组蛋白可作为ELISA 的包被抗原。随后，本试验对基于p30-gp90融合蛋白的间接ELISA方法进行了优化，并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了评价。结果显示，本试验所建立的间接ELISA 方法对其他常见禽类病原体的阳性血清无交叉反应；其灵敏度是IFA 的8 倍，是商品化ELISA 抗体检测试剂盒的2 倍；且本试验所建立间接ELISA 方法的批内和批间变异系数均小于10%。最后，使用本试验所建立的方法对收集的690 份临床血清进行检测，结果表明，同IFA 相比，p30-gp90 间接ELISA 方法的总体符合率为96.96%。上述结果证实，本方法具有良好的特异性、灵敏度和特异性。

综上所述，本试验建立了基于p30-gp90 融合蛋白的REV 抗体间接ELISA 检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于RE 临床诊断和监测，为有效防控REV 传播流行提供了良好的技术手段。