银杏黄酮降低口腔溃疡复发率的相关免疫学分析

张轶涵，张浩然，李婉亭，马文博

（齐齐哈尔医学院 黑龙江，齐齐哈尔 161099）

在口腔黏膜疾病中，复发性阿弗他溃疡（recurrent aphthous ulcer,RAU）作为常见的发病率高的溃疡类疾病，其容易反复发作，使患者深受困扰。该发病机制尚不明确，目前多数认为因口腔溃疡免疫功能异常、致病因素与遗传基因、细菌病毒感染、过敏、微量元素缺乏、系统性疾病与激素失调、情绪压力等因素相关，但确切因素尚不明确。近年来RAU 的发生和复发普遍认为其因免疫功能异常引起。当前RAU 与T 细胞免疫等作为国内外学者研究的热点，已经证实RAU 与T细胞免疫方面具有一定的关联性。

银杏叶提取物对于人体脾细胞抗体具有促进生成作用，并能通过调整CD4+/CD8+T 细胞亚群比值提高小鼠免疫功能。本实验主要研究从银杏提取物—银杏黄酮对于RAU 大鼠外周血T 淋巴细胞亚群的影响，其不仅可以进一步证明银杏提取物—银杏黄酮对于免疫功能增强的作用，还可以凭此降低口腔溃疡的复发率，减少患者对于RAU 反复发作所带来的痛苦。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 选取体重为180～220 g 的SPF 级SD 大鼠50 只、雌雄参半，由辽宁省实验动物资源中心辽宁长生生物技术股份有限公司提供，分笼饲养，室温22℃～25℃，允许适当进食。

1.1.2 主要药物和试剂 24% 银杏叶提取物—银杏黄酮（批号：SQYX20150415）购自西安圣青生物科技有限公司，五氟尿嘧啶购自合肥巴斯夫生物科技有限公司，左旋咪唑购自广东华南药业集团有限公司，10%水合氯醛购自美国WABCAN 公司，FITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8 单克隆抗体均购自Thermo-Fisher Scientific-CN 有限公司，红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司，PBS 缓冲液购自江苏凯吉生物科技有限公司，EDTA 购自广州邦标医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将50 只SD 大鼠适应性喂养1 周后按随机数字表法分为空白组、模型组、阳性对照左旋咪唑组、低剂量银杏黄酮组［5 mg/（2 mL·d）］、高剂量银杏黄酮组［20 mg/（2 mL·d）］，每组10只。除空白组外，其余各组大鼠进行口腔溃疡模型制造，通过观察伤口直径，判断造模成功与否。

1.2.2 溃疡模型制备 使用化学灼烧法进行溃疡模型制备：适应性饲养后，在造模前2 天和造模当天分别注射5-氟尿嘧啶（剂量50 mg/kg）。造模当天给大鼠腹腔注射10%水合氯醛，按0、3 mL/100 g剂量麻醉，使用止血钳将大鼠上下颌撑开、固定。将直径5～10 mm 的氢氧化钠晶体准确放置于右侧颊黏膜处，维持接触5～10 s，以口腔颊部黏膜溃疡出血为造模完成。48 h 后形成口腔溃疡模型，本模型可维持7～14 d。见图1、2。

图1 大鼠造模后口腔溃疡面积

图2 银杏黄酮高剂量治疗4 d 后口腔溃疡面积

1.2.3 药物干预 银杏黄酮低高剂量组组别分别按照5 mg/（2ml·d）、20 mg/（2 mL·d）每日1 次灌胃，左旋咪唑阳性对照组按照2 mg/（2ml·d）每日1 次灌胃。常组和模型组每日1 次分别使用等体积生理盐水1 次/d 灌胃，共计灌胃14 d。实验动物自由饮水，给予适当饮食，每日测量黏膜溃疡面直径1 次。

1.2.4 标本采集 连续给药两周，末次给药后进行腹主动脉采血，采取2 mL 血液置于EDTA 抗凝管。各组取抗凝管内保存的血液100 μL 置于离心管内，分别依次滴加FITC-CD3、APC-CD4 和PE-CD8单克隆抗体10 μL，20 min 后滴加红细胞裂解液1.5 mL 裂解红细胞，避光孵育10 min 后以1 200 r/min离心5 min。取沉淀经PBS 充分冲洗滴加PBS 500 μL重悬细胞，用流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴细胞水平，并计算CD4+/CD8+比值（用流式细胞术测定外周血T 淋巴细胞亚群）。用ELISA 检测血清白细胞介素-2（IL-2）水平。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（-x±s）表示，比较用方差分析，组间比较用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠IL-2 水平与溃疡愈合天数比较

各组大鼠IL-2 水平与溃疡愈合天数比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠IL-2 水平与溃疡愈合天数比较（n=10,）

表1 各组大鼠IL-2 水平与溃疡愈合天数比较（n=10,）

注：1）与正常组比较，P<0.05；2）与模型组比较，P<0.05。

2.2 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群水平比较

各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群水平比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群水平比较（n=10,）

表2 各组大鼠外周血T 淋巴细胞亚群水平比较（n=10,）

注：1）与正常组比较，P<0.05；2）与模型组比较，P<0.05。

3 讨论

轻型RAU 是一种周期性、复发性、自限性疾病，其发病因素并非单一因素所致，而是由复杂的、动态的及多种因素共同作用导致。李瑞泽等［1］认为，细菌病毒感染、微量元素缺乏、过敏、系统性疾病和激素失调、情绪压力及局部因素等原因均是可以引发口腔溃疡的明显症状。目前被更多学者们普遍接受的观点是在RAU 中免疫因素有着十分强大的作用。目前认为在RAU 的发病过程中，不管是细胞免疫功能低下还是细胞因子水平紊乱，其都对RAU 的发生、发展起到重要影响。对于细胞免疫来说，T 淋巴细胞总值（CD3+）及其亚群（CD4+、CD8+）的相对比例决定了在面对RAU 疾病时，其免疫功能发挥的作用。有文献已经表明，RAU 患者均为细胞免疫低下状态，且以CD4+指标低下为主［2］。

白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等均是调节机体免疫功能的重要细胞因子。在RAU 患者外周血中，尤其发现IL-2 水平较健康人明显下降，其导致了患者免疫功能的异常，进而为口腔溃疡致病菌群提供了机会［3］。在T 淋巴细胞中，CD4所分泌的IL-2 具有促进细胞增殖的作用［4］，通过增强T 细胞的活性从而加速自身清除炎症的速度，全面促进溃疡愈合［5］。

由于RAU 的复发率可高达50%，目前认为终止复发>1 年即可表示轻型RAU 痊愈。目前为止，无彻底根治RAU 的特效方法。传统的具有消炎止痛作用的口腔黏膜贴剂、氯己定含漱液等方法无法延长该病的发病间期。银杏黄酮作为口腔溃疡免疫方向的研究热点之一，多种现象表明研究可从减少复发率的角度入手。降低复发率可以有效控制口腔溃疡的再次发生，减少患者的疼痛不适感。银杏黄酮作为近年来所发现的一种调节免疫的药物，有文献已经表明，其可以增强IL-2 的分泌作用，进而提高人体免疫力［6］。还有就是给患者应用银杏黄酮一段时间后，患者外周血的T 淋巴细胞亚群CD3+CD4+比值明显升高，从而证明银杏黄酮有增强细胞免疫的功能。

综上所述，本研究以银杏黄酮作为主要药物、以大鼠外周血T 淋巴细胞亚群免疫细胞CD4+/CD8+比值作为主要指标对银杏黄酮治疗口腔溃疡的效果进行实验研究，得出结论就是银杏黄酮可使大鼠T 淋巴细胞中CD4+/CD8+比值升高，且使IL-2水平升高，说明银杏黄酮可使机体特异性免疫功能增强。因此证明银杏黄酮对治疗口腔溃疡有明显疗效，其可减少口腔黏膜溃疡面积和溃疡愈合时间，提高机体的免疫功能，进而减少RAU 复发率。所以银杏黄酮在治疗口腔溃疡、减少复发率、减轻症状等方面存在重大研究价值与潜能。目前对口腔溃疡的治疗研究依然有限，还需要更高质量的临床研究验证其作用；另外在免疫抑制人群中更应当注意银杏黄酮的谨慎使用，避免其不良反应的发生［7］。