结核杆菌显微扫描仪在结核形态学镜检的诊断价值研究*

朱圣辉，廖乘胜，施旭东，杨鹏，张圣贤

（宁波舜宇仪器有限公司，浙江 宁波 315408）

据全国第五次结核病流行病学抽样调查［1］，2010 年我国15 岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10 万，涂阳肺结核患病率为66/10 万，我国仍是结核病高负担国家。对于结核的实验室检查，目前可以用到的方法有很多，比如细菌学检测中的直接涂片法和培养法，分子检测中的GENE XPERT，免疫学检测中的结核菌素试验皮试，免疫球蛋白（IgG）检测，T 细胞斑点试验（T-SPOT.TB）检测等［2-4］。而细菌学检测中的痰涂片检查由于其操作简便，结果直观，成本低廉优势，一直都是实验室检查中的常用方法，涂片发现抗酸杆菌，是结核诊断的有力证据［5-6］。

目前的痰涂片镜检的常用方法是萋-尼抗酸染色法，操作要求［7-8］镜检人员用100X 油镜观察每张玻片的50～300 个不同视野，特别是对于弱阳或阴性的标本，实验室质控要求至少观察300 个视野，这对镜检人员而言是很大的负担，并且非常容易发生漏检。而结核杆菌扫描仪可以扫描每张片子的至少300 个视野，并通过算法进行辅助诊断，极大的减轻了人工镜检的工作量。为验证扫描仪的检验性能，本研究收集了痰液标本1 266例，采用人工直接涂片法和萋-尼抗酸染色法，随后对比人工镜检的结果和设备扫描的结果，以液体培养法为金标准，研究扫描仪对于抗酸杆菌检出的敏感性和特异性，探讨扫描仪的应用价值。

1 资料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器 中国宁波舜宇仪器有限公司生产光学显微镜EX30，采用100X 油镜观察；中国宁波舜宇仪器有限公司生产结核杆菌显微扫描仪FS50。

1.1.2 试剂 中国珠海贝索生物技术有限公司生产抗酸染色液与痰消化液，美国BD 公司生产MGIT 培养试剂。

1.2 实验过程

中国科学院大学宁波华美医院2019 年3 月至6 月的结核门诊患者1 266 例，按照标准［9］采集脓样痰，干酪样或粘液3～5 mL。

标本制备：用折断的竹签茬端挑取标本中干酪样，脓样或可疑部分在一张玻片上涂抹成10×20 mm 的卵圆形痰膜，随后采用萋-尼抗酸染色法进行抗酸染色［5］。

镜检：染色后的片子晾干后放至结核杆菌显微扫描仪进行扫描和结果判读。将染色晾干后的涂片放入扫描仪的料盒，料盒放入扫描仪主机后选中需要扫描的标本进行扫描，随后在软件阅片界面进行结果审阅和记录；机器判读完成后，由经验丰富的结核实验室工作者对片子进行人工显微镜观察，在100X 油镜下连续观察300 个不同视野，结核分枝杆菌在蓝色背景下呈细长略带弯曲的红色杆状。

结核杆菌显微扫描仪工作原理：通过对痰涂片进行显微扫描，并对扫描图像进行结核分枝杆菌的识别，分类，最终提供辅助诊断结果。

结果判读：萋-尼染色抗酸杆菌阴性：未发现抗酸杆菌；萋-尼染色抗酸杆菌阳性（报告条数））：抗酸杆菌菌数1～8 条/300 视野；萋-尼染色抗酸杆菌阳性（1+）：3～9 条/100 视野，连续观察300 个视野；萋-尼染色抗酸杆菌阳性（2+）：1～9 条/10 视野，连续观察100 个视野；萋-尼染色抗酸杆菌阳性（3+）：1～9 条/1 视野；萋-尼染色抗酸杆菌阳性（4+）：≥10 条/1 视野。报告1+时至少观察300 个视野，报告2+至少观察100 个视野，3+、4+时至少观察50 个视野。

液体培养：剩余痰液标本采用BACTEC MGIT分枝杆菌检测仪进行培养检测。在标本中加入与标本等量的NALC-NaOH 混合溶液；旋紧盖子后涡旋震荡30 s，室温静置15～20 min，勿超过20 min，以防杀死结核菌。在液化后的标本中加入pH6.8 的PBS 缓冲液至40～45 mL，3 000 g 离心15 min，缓慢倒弃上清液至废液瓶。加入1～3 mL pH6.8 的PBS 缓冲液，重悬沉淀，处理后的标本接种到相应的培养管内进行液体培养。

结果判读：如果仪器报告阳性，应按照液体培养基的要求对培养液进行涂片染色镜检。如果涂片检查为抗酸菌阳性，则报告培养阳性；如果难以确定，可用革兰染色法判定。如果涂片检查发现有非抗酸菌存在，则报告污染。如果任何微生物皆未发现，应继续培养；6 周培养仪器未报告阳性，则判定为培养阴性。如果抗酸染色阴性且没有明显污染的培养管，可以继续观察，几天后，重复抗酸涂片［10-11］。

质量控制：要求每一批次涂片染色都要做阳性对照和阴性对照。用结核分枝杆菌（H37Rv,ATCC27294）作阳性对照。其他细菌如大肠杆菌的菌悬液可作为阴性对照。阳性对照的抗酸染色结果呈阳性，而阴性对照的抗酸结果为阴性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（）表示，用t检验；计数资料以百分率（%）表示。约登指数=灵敏度+特异度−1。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

显微扫描设备的平均检测时间为（1.5±0.2）min/例标本，人工镜检组为（4.2±1.1）min/例标本，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）。以BD 液体培养法检测结果为诊断结核的标准，结核杆菌显微扫描仪的灵敏度和特异度分别为51.56%和96.94%，人工镜检的灵敏度和特异度分别为43.23% 和99.66%。显微扫描仪的尤登指数为0.49，人工镜检的尤登指数为0.43。见表1。

表1 仪器镜检与人工镜检结果比较（例）

3 讨论

抗酸涂片检查是结核病实验室最常用的检测方法之一，在显微镜下发现抗酸杆菌，是诊断分枝杆菌的有力证据。因此萋-尼抗酸染色法常用于结核病的诊断［12］。传统的萋-尼抗酸染色法流程是人工涂片染色，随后人工镜检［13］。整体实验流程费时费力［14-15］，特别是人工镜检环节，按要求，每个实验人员每个工作日阅片量不能超过25 片，且连续阅片10～12 张后应休息20 min。但在实际工作中，很多结核病实验室工作人员工作量大，经常存在单日阅片量超过25 张的情况。

以培养结果作为金标准，进而比较结核杆菌显微扫描设备和人工镜检的检测效率。显微扫描设备与人工镜检的灵敏度分别为51.56% 和43.23%，特异度分别为96.94% 和99.66%，约登指数分别为0.49 和0.43。显微扫描仪的诊断效率高于人工镜检。

本研究的1 266 例标本中，有58 例标本两种检测方法不一致，其中54 例标本人工镜检为阴性，结核杆菌显微扫描仪阳性，4 例标本显微扫描仪结果阴性而人工镜检为阳性。查找实验结果发现，这58 例标本的阳性等级范围都在1 条/300 视野至1+，其中显微扫描仪漏检的4 例标本，人工镜检结果分别为1 条/300 视野，1 条/300 视野，2 条/300 视野，3 条/300 视野。分析漏检原因，结核杆菌显微扫描仪只扫描300 个视野，而10×20 mm 的卵圆形的痰膜整体视野数量在5 000 个以上，因此阳性级别较低的标本可能会因为视野盲区而产生漏检。如果增加扫描视野数量，就可以增加扫描仪的检出率，降低漏检率。分析人工镜检的漏检原因，主要有两点：一是视野盲区，二是镜检操作人员由于观察遗漏和视觉疲劳。对比人工镜检和扫描仪的漏检数量，两种方法的每个标本视野数量基本一致，因此造成人工漏检的主要原因是第二点。

综上所述，结核杆菌显微扫描仪镜检与人工镜检均属于形态学镜检，显微扫描仪镜检与人工镜检的特异度比较差异不明显，敏感性上优于人工镜检，且极大的缩短了镜检时间，大大减轻了操作人员的工作量。因此结核杆菌显微扫描仪用于结核实验室涂片找抗酸杆菌的筛查，适宜在各级结核病实验室进行推广应用。