水牛Tle6基因表达模式分析及其多克隆抗体制备

陈东荣 黄星晨 张俊俊 杨维菡 张明 付强

摘要：【目的】明確水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式，并通过构建原核表达载体诱导表达融合蛋白及免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体，为进一步揭示Tle6基因在水牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。【方法】采用RT-PCR扩增水牛Tle6基因编码区（CDS）序列，经生物信息学分析后，分别以半定量PCR和实时荧光定量PCR检测分析水牛Tle6基因表达组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式。构建重组原核表达载体，以IPTG诱导表达的融合蛋白免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体，再利用TLE6多克隆抗体检验TLE6蛋白在水牛不同组织及卵母细胞和早期胚胎中的表达情况。【结果】水牛Tle6基因CDS序列全长1731 bp，编码576个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为64.09 kD，理论等电点（pI）为5.69，属于亲水性蛋白。Tle6基因仅在水牛的卵母细胞中特异性表达。重组原核表达载体pET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导6 h，融合蛋白TLE6的表达量最高，且以可溶性蛋白和包涵体2种形式进行表达;以纯化的融合蛋白TLE6免疫小鼠成功制备获得TLE6多克隆抗体，其抗体效价为1∶64000，能与融合蛋白TLE6及水牛卵母细胞发生特异性反应，即具有很强的特异性。【结论】Tle6基因仅在水牛卵母细胞中特异性表达，而在其他组织中未见表达。不同于其他MEGs的表达模式，Tle6基因在水牛卵母细胞及胚胎早期发育过程中呈特异性持续表达，可能在水牛卵母细胞成熟及附植前的胚胎发育过程中发挥重要作用。

关键词： 水牛;Tle6基因;卵母细胞;胚胎;多克隆抗体;母源效应基因

Abstract：【Objective】Characterization of the Tle6 gene expression profile and its expression in different tissues， oocytes and preimplantation embryos in buffalo were studied. TLE6 polyclonal antibody was prepared by constructing a prokaryotic expression vector with induced fusion protein expression and immuned mice. This study laid the foundation for studying the function and regulation mechanism of Tle6 gene in buffalo reproduction development. 【Methods】The sequence of Tle6 gene coding region（CDS） of buffalo was amplified by RT-PCR. After bioinformatics analysis， a prokaryo-tic expression vector was constructed. The mouse were immunized by IPTG induced TLE6 recombinant protein for preparing the polyclonal antibody. The expression profiles of TLE6 protein in different tissues， oocytes and preimplantation embryos of buffalo was examined using TLE6 polyclonal antibody. 【Result】The CDS sequence of buffalo Tle6 gene consisted of 1731 bp， encoding 576 amino acids with the molecular weight of 64.09 kD and isoelectric point（pI） of 5.69. The TLE6 protein belonged to a hydrophilic protein. The Tle6 gene was specificly expressed in oocytes of buffalo. The recombinant pET-32a-Tle6 prokaryotic expression vector was transfer to BL21（DE3） competent cell. TLE6 protein had highest expression by 6 h IPTG induced. TLE6 protein was expressed in two forms：soluble protein and inclusion body. The TLE6 polyclonal antibody was prepared successfully by purified fusion protein TLE6 immunity mouse. The antibody titer was 1∶64000. It had specific reactions with the fusion protein TLE6 and buffalo oocytes， with strong specificity. 【Conclusion】The Tle6 gene is specifically expressed only in buffalo oocytes and is not expressed in other tissues. Different from other MEGs expression pattern， the buffalo Tle6 gene continuously expresses in oocytes and preimplantation embyros， indica-ting that may be function in oocyte maturation and preimplantation embryo development in buffalo.

Key words： buffalo; Tle6 gene; oocyte; embryo; polyclonal antibody; maternal effect genes

0 引言

【研究意义】Tle6（Transducin like enhancer 6）基因是在哺乳动物中新发现的母源效应基因（Maternal effect genes，MEGs），其编码蛋白TLE6称为转录素样增强子6，与Floped、Mater和Filia基因的编码蛋白在小鼠卵母细胞及早期胚胎中组成母源效应复合体（Subcortical maternal complex，SCMC）（Li et al.，2008）。SCMC是一种在哺乳动物卵母细胞及早期胚胎中特异表达的多蛋白复合物，其成分均由MEGs编码（Li et al.，2008），可能是哺乳动物母源调控向合子调控轉变的关键枢纽，对早期胚胎发育具有调控作用（王梦月和周红林，2012;Bebbere et al.，2016;王晓晴等，2018）。因此，深入研究水牛Tle6基因的生物学功能对揭示其在水牛卵母细胞成熟及胚胎发育中的作用机理具有重要意义。【前人研究进展】Tle6基因属于Groucho/TLE转录共抑制基因家族成员（Jennings and Ish-Horowicz，2008），该家族包含6个主要成员基因（Tle1～Tle6）。Tle1～Tle4基因是全长基因，而Tle5和Tle6基因是可抑制Tle1～Tle4基因功能的短型基因（Feng et al.，2020）。早期研究发现，Tle6基因可调节小鼠和绵羊的早期胚胎发育及细胞分裂（Bebbere et al.，2014）;在敲除Tle6基因的雌性小鼠中，其早期胚胎停滞在2-细胞阶段，雌性小鼠繁殖能力完全丧失，进一步证实Tle6基因是胚胎发育过程中2-细胞期所必需的MEGs。TLE6是在小鼠卵母细胞及早期胚胎中形成SCMC的必需蛋白，具有调节肌动蛋白细胞骨架而控制受精卵对称分裂的作用（Yu et al.，2014）。TLE6和SCMC共定位于卵母细胞及早期胚胎皮质下（Zhu et al.，2015）;TLE6还是一种环磷酸腺cAMP依赖性蛋白激酶A底物，在减数分裂恢复后被磷酸化（Duncan et al.，2014）。TLE6磷酸化由蛋白激酶A调控（Duncan et al.，2014;王晓晴等，2018），但具体的生理学意义有待进一步探究。Alazami等（2015）、Lin等（2020）研究表明，Tle6基因突变会导致卵裂期胚胎发育停滞，究其原因是由于TLE6与蛋白激酶A的相关位点不能被磷酸化。Wang等（2018）、Mohebi和Ghafouri-Fard（2019）在反复流产妇女的卵母细胞中发现Tle6基因突变，其表型与敲除Tle6基因小鼠的表型相似。Bebbere等（2020）研究表明，Tle6基因在绵羊青年及成年期的卵母细胞发育过程中转录活跃，且绵羊年龄与卵母细胞mRNA丰度呈负相关。Feng等（2020）研究发现敲除Tle6基因后小鼠精原细胞增殖缓慢，即Tle6基因可调控精原细胞的增殖及其细胞周期。可见，Tle6基因在动物生殖发育中起关键作用，且在细胞及胚胎发育过程中发挥重要的调控功能。【本研究切入点】目前，针对Tle6基因的研究主要集中在人类和小鼠上，而有关Tle6基因对水牛卵母细胞及早期胚胎发育影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】克隆水牛Tle6基因编码区（CDS）序列，采用RT-PCR和实时荧光定量PCR分别检测分析Tle6基因表达的组织特异性及其在卵母细胞和早期胚胎中的表达模式，并通过构建原核表达载体诱导表达融合蛋白及免疫小鼠而获得TLE6多克隆抗体，以期为进一步揭示Tle6基因在水牛生殖发育中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

水牛卵巢等组织取自南宁市肉联厂屠宰分厂;大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;高保真酶及胶回收和质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;RNA微量提取试剂盒购自QIAGEN公司;cDNA反转录试剂盒、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶及限制性内切酶购自TaKaRa公司;HRP标记马抗小鼠IgG和FITG驴抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1. 2 引物设计与合成

从NCBI下载水牛Tle6基因（XM_025293142.1），采用SnapGene设计扩增引物（表1）。所有引物均委托深圳华大基因科技有限公司合成。

1. 3 RNA提取及cDNA合成

通过RNA微量提取试剂盒提取水牛卵母细胞总RNA，采用TRIzol法提取水牛大脑、心脏、肝脏及肾脏等组织总RNA，检测总RNA的浓度和纯度后，以cDNA反转录试剂盒反转录合成cDNA。

1. 4 PCR扩增

PCR反应体系25.0 μL：cDNA模板2.0 μL，2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNase-free H2O 8.5 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，进行34个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，确定扩增目的片段正确后，向PCR扩增产物中加入10.0 μL 2×Rapid Taq Master Mix，72 ℃作用20 min，即加poly（A）尾。通过胶回收试剂盒回收目的片段，连接至pMD18-T载体上，再转化DH5α感受态细胞，并平铺于含氨苄青霉素的LB培养基上。37 ℃培养12 h后挑选单一菌落进行PCR鉴定，阳性菌落送至深圳华大基因科技有限公司测序。

1. 5 Tle6基因生物信息学分析

采用SeqMan将测序结果拼接成完整的Tle6基因CDS序列，通过MegAlign进行同源比对分析，基于Tle6氨基酸序列相似性以MEGA 5.0构建系统发育进化树，并利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析。

1. 6 半定量PCR检测分析

采集水牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、脊髓、舌头、喉咙、胃、肌肉、脂肪、睾丸、子宫和卵巢等组织样品及卵母细胞，提取总RNA反转录合成cDNA。以cDNA为模板、GAPDH为内参基因，进行半定量PCR检测分析，具体PCR反应体系及扩增程序同1.4，PCR扩增产物以1.0%琼脂糖胶电泳进行检测。

1. 7 原核表达载体构建

通过RNA微量提取试剂盒提取水牛卵母细胞总RNA，再反转录合成cDNA。参考Tle6基因抗原表位及免疫原性，采用SnapGene设計含限制性内切酶EcoR I和Hind III位点引物（5'-CGGAATTCGGGA TCCAGGAGCATCTCAAGCA-3'和5'-CCCAAGCTT GGACGTCTTCGAAGTCTAGATCCTG-3'）（划线部分为酶切位点），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。将酶切获得的目的片段连接至pMD18-T载体上，构建重组质粒pMD18-T-Tle6，然后双酶切重组质粒pMD18-T-Tle6和原核表达载体pET-32a（+），按3∶1的比例在T4 DNA连接酶作用下16 ℃连接6～8 h，接种至LB培养基上，挑选阳性克隆提取质粒并进行双酶切鉴定。

1. 8 融合蛋白表达及纯化

以测序正确的重组原核表达载体pET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞，摇床培养至菌液OD600 nm达0.6左右时加入最终浓度0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃下诱导6 h，加入溶解酶，在液氮中反复冻融裂解菌体，12000 r/min离心2 min，分别收集上清液和包涵体沉淀进行SDS-PAGE电泳分析。采用Ni-NTA亲和层析柱纯化可溶性融合蛋白，并以His标签进行鉴定。

1. 9 多克隆抗体制备与鉴定

将纯化后的融合蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混合，匀浆乳化，于小鼠背部皮下多点注射1 mL;第2次免疫及以后的加强免疫均采用弗氏不完全佐剂与融合蛋白等体积混合乳化。共免疫4次，最后1次免疫后间隔7 d采集小鼠血清样品，-80 ℃保存。使用Western blotting检验TLE6多克隆抗体效价，同时以TLE6多克隆抗体为一抗检验TLE6蛋白在水牛卵母细胞、颗粒细胞及脑、心脏、肾脏和肌肉等组织中的特异性表达情况。收集300枚GV期的水牛卵母细胞及一定量的颗粒细胞，通过液氮反复冻融提取蛋白;脑、心脏、肾脏和肌肉等组织通过液氮研磨，加入800 μL含1%苯甲基磺酰氟（PMSF）的细胞裂解液RIPA提取蛋白。经SDS-PAGE电泳后置于半干转机上转膜90 min，以5%脱脂牛奶37 ℃封闭2 h，加入制备的TLE6多克隆抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗涤4次，每次5 min;加入HRP标记马抗小鼠IgG，37 ℃孵育1 h，TBST洗涤4次，每次5 min;碱性磷酸酯酶显色后进行成像分析。

1. 10 卵母细胞及早期胚胎免疫荧光染色

将收集的水牛卵母细胞和早期胚胎分别用含0.1%聚乙烯醇（PVA）的DPBS漂洗3次，4%多聚甲醛溶液固定30 min后以含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;转移至1% Triton X-100室温透膜8 h，再用含0.1% PVA的DPBS漂洗3次;室温下用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭2 h，将水牛卵母细胞和早期胚胎转移至1∶400的抗体血清稀释液（一抗）中，4 ℃孵育过夜;用含0.1% Tween-20和0.01% Triton X-100的PBS漂洗3次，每次漂洗时间不少于5 min;然后将水牛卵母细胞和早期胚胎转移至以PBS（含1% BSA）稀释的FITC驴抗小鼠IgG中，室温避光孵育1 h，同样方法漂洗5次，每次5 min;最后滴加含DAPI的抗荧光淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察及拍照。

2 结果与分析

2. 1 水牛Tle6基因克隆及测序分析结果

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到的条带（图1）与预期结果相符，采用SeqMan将3段测序结果拼接成完整的CDS序列，得到水牛Tle6基因CDS序列全长1731 bp，编码576个氨基酸残基，其编码蛋白分子量为64.09 kD。

2. 2 水牛Tle6基因系统发育进化树分析结果

从NCBI上搜索并下载绵羊（XM_027970670.1）、山羊（XM_018050789.1）、牛（XM_010807024.3）、野猪（XM_021084149.1）、大鼠（XM_032909218.1）、小鼠（NM_053254.2）、猕猴（XM_028839646.1）、人类（XM_005259645.2）和倭黑猩猩（XM_008972692.1）等物种的Tle6核苷酸序列，通过MegAlign进行同源比对分析并构建系统发育进化树。结果（图2）显示，水牛Tle6核苷酸序列与牛、山羊、绵羊和野猪的Tle6核苷酸序列相似性分别为97.5%、95.8%、95.6%和81.5%。

2. 3 水牛TLE6蛋白生物信息学分析结果

水牛TLE6蛋白分子量为64.09 kD，理论等电点（pI）为5.69，分子式为C2824H4365N801O862S24。ExPasy ProtScale预测结果（图3）显示，水牛TLE6蛋白亲水性平均系数为-0.447，属于亲水性蛋白。通过PFAM数据库预测水牛TLE6蛋白功能结构域，结果（图4）发现该蛋白是由2种结构域组成，较前端是复杂程度低的简单序列，后端是重复的WD40结构域，属于转录辅阻遏蛋白家族成员。通过DNASTAR对水牛TLE6蛋白二级结构进行预测，结果（图5）发现其二级结构包含24个α-螺旋、46个β-折叠、43个β-转角及43个无规则卷曲。SWISS-MODEL预测结果（图6）表明，水牛TLE6蛋白以α-螺旋和β-折叠结构为主。

2. 4 Tle6基因在水牛不同组织中的表达情况

由图7可知，Tle6基因仅在水牛的卵母细胞中表达，在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、脊髓、舌头、喉咙、胃、肌肉、脂z肪、睾丸、子宫及卵巢等组织中均不表达。

2. 5 水牛Tle6基因原核表达载体构建结果

采用含酶切位点的引物对水牛Tle6基因进行PCR扩增，结果获得198 bp目的片段，连接至经Hind III和EcoR I双酶切后的原核表达载体pET-32a（+）上，即获得重组原核表达载体pET-32a-Tle6，然后转化BL21（DE3）感受态细胞并接种至LB培养基上，挑选阳性克隆，提取质粒进行双酶切处理，再以含酶切位点的引物进行PCR鉴定，结果在200 bp附近获得1条明亮清晰的单一条带（图8），与预期结果相符，说明水牛Tle6基因已插入原核表达载体pET-32a（+）。送至深圳华大基因科技有限公司的测序结果也表明，水牛Tle6基因已正确插入原核表达载体pET-32a（+），即成功构建获得重组原核表达载体pET-32a-Tle6。

2. 6 融合蛋白TLE6诱导表达及纯化结果

重组原核表达载体pET-32a-Tle6转化BL21（DE3）感受态细胞，经IPTG诱导6 h，融合蛋白TLE6的表达量达最高值，以可溶性蛋白和包涵体2种形式进行表达。由于可溶性蛋白的纯化过程较包涵体的简便，因此后续试验选择可溶性蛋白（上清液）为研究对象。融合蛋白TLE6经Ni-NTA亲和层析柱纯化，其SDS-PAGE电泳结果显示约在25.00 kD处出现预期的目的蛋白条带（图9-A），且纯化后融合蛋白TLE6的杂带较未纯化融合蛋白明显减少，即蛋白纯化效果良好，可用于免疫小鼠制备多克隆抗体。以His标签检验复性后的可溶性融合蛋白TLE6，Western blotting检验结果显示得到1条约25.00 kD的特异性目的条带（图9-B），进一步说明融合蛋白TLE6纯化效果良好。

2. 7 TLE6多克隆抗体效价

以纯化的融合蛋白TLE6免疫小鼠制备TLE6多克隆抗体（血清），按梯度等比（1∶1000～1∶64000）稀释后，与融合蛋白TLE6进行Western blotting检测分析，结果（图10）显示在25.00 kD附近能检测到预期的目的条带，表明已成功制备获得TLE6多克隆抗体，其抗体效价为1∶64000。

2. 8 TLE6蛋白在水牛不同组织中的表达情况

以TLE6多克隆抗体为一抗，按1∶8000稀释后用于检测TLE6蛋白在水牛不同组织及卵母细胞和颗粒细胞中的表达情况。结果表明，TLE6蛋白仅在水牛卵母细胞中表达（图11），在其他细胞和组织中均无表达分布（图12），其目的蛋白大小为64.00 kD。在水牛卵母细胞样品中，目的蛋白条带单一且无杂带，表明制备获得的TLE6多克隆抗体具有很强特异性。

2. 9 TLE6蛋白在水牛卵母细胞及早期胚胎中的表达情况

为进一步确定TLE6蛋白在水牛卵母细胞中的表达情况，分别收集不同发育期的水牛卵母细胞及早期胚胎进行免疫荧光染色。免疫荧光染色结果（图13）显示，在不同发育期的水牛卵母细胞及早期胚胎中均能发现TLE6蛋白荧光信号，表明TLE6蛋白在水牛卵母細胞成熟过程持续表达，但呈逐渐降低的变化趋势，故推测TLE6在水牛卵母细胞的发育过程中扮演重要角色。

3 讨论

Tle6基因是Groucho/TLE转录共抑制基因家族成员之一，在小鼠胚胎和成年鼠的组织中广泛表达（Dang et al.，2001）。Tle6基因于2005年首次在发育中的人类大脑皮层神经祖细胞中被鉴定（Li et al.，2008）。Bebbere等（2014）研究发现，TLE6蛋白仅在绵羊卵母细胞及胚胎中表达，在其他胚泡、肺脏、肌肉、肾脏、小脑、睾丸、卵巢、脾脏、肝脏及心脏等组织中均未检测到相应的转录本;而Zhu等（2015）研究发现人类的TLE6转录本在卵巢和肾脏中高表达。TLE6能与MATER、FLOPED和FILIA等已证实的母源性蛋白结合形成SCMC。TLE6与SCMC的其他成员一样定位于小鼠卵母细胞及早期胚胎的皮质下，在Tle6基因缺失小鼠中无法形成SCMC，导致纺锤体偏移，最终产生大量不均等的2-细胞胚胎，随后胚胎发育停滞（Yu et al.，2014），即Tle6基因是小鼠的MEGs。至今，Tle6基因功能仅在小鼠中被证实，针对大型家畜的Tle6基因功能尚无研究报道，其在水牛卵母细胞及胚胎早期发育过程中是否作为母源性基因有待进一步探究。

本研究结果表明，Tle6基因仅在水牛卵母细胞中表达，在其他组织均无表达，揭示Tle6基因在水牛卵母细胞的生长发育过程中扮演重要角色，与已报道的小鼠Tle6基因（Yu et al.，2014）一致。水牛Tle6核苷酸序列与牛、山羊、绵羊和野猪的Tle6核苷酸序列相似性分别为97.5%、95.8%、95.6%和81.5%，说明Tle6基因具有较高的保守性。小鼠TLE6蛋白包含581个氨基酸残基，分子量为65.00 kD（Feng et al.，2020）;而水牛TLE6蛋白由576个氨基酸残基组成，其分子量为64.09 kD，属于亲水性蛋白，说明Tle6基因在不同物种间的转录本表达也有所不同。TLE6蛋白功能结构域预测结果显示，其具有5个色氨酸—天冬氨酸重复单元（WD）（Li and Roberts，2001），但缺少与Groucho/TLE寡聚化有关的2个与特定转录因子结合的氨基酸，能介导并参与大多数转录因子（羧基末端的WD40重复结构域）的相互作用（Marcal et al.，2005）。

在小鼠中，Tle6基因转录本在卵母细胞的发生过程中积累，于生发泡破裂期（GV）达高峰，从减数分裂成熟和排卵后开始降解，在胚胎发生过程中完全消失;但TLE6蛋白在植入前的胚胎中一直持续表达至囊胚阶段（Li et al.，2008）。本研究的实时荧光定量PCR检测结果显示，Tle6基因水牛卵母细胞发育至桑椹胚前均有表达，且以4-细胞期的相对表达量最高，随后开始呈下降趋势，在桑椹胚阶段其相对表达量急剧下降，至囊胚期未能检测到Tle6基因表达，揭示Tle6基因在水牛卵母细胞生成及胚胎早期发育过程中发挥一定功能作用，但不同于小鼠Tle6基因的表达模式，故推测水牛Tle6基因并非MEGs。

本研究選择常用的大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞为表达菌株，采用含His标签的pET-32a（+）载体为原核表达载体，His标签可鉴定融合蛋白是否正确表达（陈东荣等，2020）。融合蛋白在大肠杆菌中的表达形式主要有2种：（1）胞外分泌可溶性蛋白，易纯化，保留融合蛋白的天然结构，简单透析除去盐分便可于免疫试验;（2）胞内表达的无活性包涵体，需经复杂的变性、复性程序才能得到有活性的融合蛋白。IPTG浓度是影响融合蛋白TLE6表达的主要因素之一，本研究的预试验通过设0.05～1.00 mmol/L共11个IPTG浓度梯度诱导融合蛋白表达，结果发现以0.5 mmol/L IPTG的诱导效果最佳。此外，本研究采用30 ℃作为诱导温度，可降低融合蛋白诱导合成的速率，而有利于提高融合蛋白的可溶性表达。以IPTG诱导表达的纯化融合蛋白TLE6免疫小鼠，成功制备获得TLE6多克隆抗体，其抗体效价为1∶64000，能与融合蛋白TLE6及水牛卵母细胞发生特异性反应，即具有很强的特异性，为深入研究TLE6蛋白在水牛卵母细胞及早期胚胎中的功能作用提供了技术支撑。

4 结论

Tle6基因仅在水牛卵母细胞中特异性表达，而在其他组织中未见表达。不同于其他MEGs的表达模式，Tle6基因在水牛卵母细胞及胚胎的早期发育过程呈特异性持续表达，可能在水牛卵母细胞成熟及附植前胚胎发育过程中发挥重要作用。

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（責任编辑 兰宗宝）