超高效液相色谱-三重四级杆质谱多反应监测模式测定奶粉中56种违禁药物残留

周春红，许晓辉

1(甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃 兰州，730000)2(兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州，730000)

喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类、硝基咪唑类为常见的抗生素药物，具有消毒杀菌的功效，广泛用于禽畜养殖过程中细菌性感染、病虫害等多种疾病的预防和治疗[1-3]。地西泮等精神类药物可降低机体新陈代谢，通过抑制中枢神经系统减弱机体生理机能从而使机体消除躁动、恢复安静的情绪[4-6]。药物的不正确使用及频繁滥用，导致其在动物体内具有相对较长的半衰期，过量残留的兽药可通过食物链进入人体，轻则引起胃肠道刺激不适、头痛、头晕、嗜睡疲乏、人体动作失调、精神混乱等症状，重则容易损害人体肝、肾、骨髓造血机能等，引起心律失常、溶血性贫血、机体代谢功能性减退甚至死亡等问题[7-10]。此外，该药物的残留，会使食用者产生耐药性，降低此类药物的临床治疗效果，对人体具有潜在危害，不容忽视。随着人们对禽畜产品的需求量逐年递增，禽畜养殖企业不断兴起和扩大。部分养殖者和商贩对食品安全认识不充分，为获取更高经济利益，并未严格遵守休药期规定，甚至短时间内使用高剂量的违禁药物，造成肉及肉制品的药物残留，是日常食品风险监测的重点。

目前，违禁药物残留的检测技术主要有气相色谱-质谱法[5,8,11]、液相色谱法[12]、液相色谱-串联质谱法[13-17]等。液相色谱法定量准确，但是存在检测药物种类单一、耗时较长、灵敏度低等问题。气相色谱-质谱法广泛用于农药残留的检测，但是对于兽药残留、精神类药物残留等检测范围较窄。鉴于超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法有高准确性、高效性、测量范围广、稳定性好等特点，以及多反应监测(multiple-reaction monitoring，MRM)模式检测的高灵敏度、高选择性等优点，超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱成为高通量筛查药物多残留的首选方法。

本文选择了56种较为常见滥用的违禁药物(包括喹诺酮类、磺胺类、糖皮质激素类、抗病毒类、精神类等)作为研究对象，以成人奶粉作为研究基质，运用QuEChERS法从提取、净化等前处理条件结合超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪所具备的检测功能，优化出可快速测定成人奶粉中违禁药物多残留的检测方法，为市场监管成人奶粉产品质量的风险评估提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

QTRAP 4500超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪，美国SCIEX公司；VXR涡旋振荡器，德国IKA公司；5810R高速低温离心机，德国Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹仪，美国Organomation公司；KQ-600DE超声波清洗器，东莞市科桥超声波设备有限公司；十万分之一天平(精密度为0.1 mg)，德国Sartorius公司；Milli-Q Gradient纯水仪，美国Millipore公司。

1.2 材料与试剂

甲醇、乙腈(均为色谱纯)，美国Merck公司；甲酸(色谱纯)，天津科密欧公司；标准品：56种待测药物标准品(表1)纯度均大于95%，德国Dr.Ehrenstofer公司。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

Waters Acquity UPLCBEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速：0.2 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸,体积分数，下同)，B为乙腈(含0.1%甲酸，体积分数，下同)；流动相梯度洗脱程序：0～3.0 min，5%～30%B；3.0～4.0 min，30%～40%B；4.0～6.0 min，40%～95%B；6.0～8.0 min，95%B；8.0～8.2 min，95%～5%B；8.2～10 min，5%B。

1.3.2 质谱条件

电喷雾电离源；检测方式：MRM模式；气帘气：35 psi；碰撞气：medium；离子化电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；喷雾气：55 psi；辅助加热器：60 psi。56种目标化合物在MRM模式下的质谱条件具体见表1。

1.3.3 溶液制备

1.3.3.1 对照品溶液制备

混合标准储备液的配制(10 μg/mL)：分别准确称取各对照品约10 mg，用乙腈稀释成1 000 μg/mL储备液。再分别移取上述储备液各100 μL，用乙腈稀释至10 mL，配制成质量浓度为10 μg/mL的混合标准工作溶液，于-20 ℃下密封保存。准确移取一定量的混合标准工作液，配制成系列空白样品基质匹配标准溶液，现用现配。

1.3.3.2 供试品溶液配制

准确称取1.0 g(精确到0.1 mg)制备好的样品于50 mL离心管中，加入5 mL水振荡混匀溶解，加入约2 g氯化钠，再加入10 mL乙腈涡旋振荡后超声10 min，以4 000 r/min离心5 min，移取上清液，待净化。

准确移取7.0 mL上清液，移至内含丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)40 mg，C1840 mg的净化管中，涡旋混匀1 min，以4 000 r/min离心5 min，收集上清液，在40 ℃下氮吹至近干，准确加入1.0 mL初始流动相溶解，过0.22 μm滤膜后，待超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-MS/MS，UPLC-MS/MS)分析。

1.3.4 方法学考察

1.3.4.1 线性关系、相关系数及检出限

根据1.3.3.2的试验条件处理空白样品，得到空白基质溶液配制成系列基质混合标准溶液，按照1.3.1和1.3.2色谱及质谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)做标准曲线，得到56种药物的线性方程、相关系数。采用空白样品加标方式考察56种药物的检出限(limit of detection,LOD)(S/N=3)和定量限(limit of quantitation,LOQ)(S/N=10)。

1.3.4.2 精密度和加标回收试验

以空白样品为基质，添加2、5、10 μg/kg 3个水平的混合标准溶液，每个加标水平做6次平行实验，采用优化后的实验条件进行测定，计算低、中、高3个添加水平的加标回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

2 结果与分析

2.1 MRM模式下药物残留检测方法的建立

2.1.1 质谱条件的优化

运用质谱进行分析时，影响化合物电离的主要因素为去簇电压(declustering potential，DP)和碰撞能量(collision energy，CE)，由于不同生产厂家或者同一厂家不同型号的质谱仪结构不同，优化得到的碎片离子响应强度及电压亦不同。本研究在参考国家标准及文献报道[16-22]的基础上，采用一级质谱扫描模式确定母离子，采用在MRM模式下找出56种目标化合物的特征子离子碎片，并优化DP和CE使各离子碎片的响应值达到最优，优化后的质谱条件如表1所示。

表1 56种待测物质的保留时间与质谱参数Table 1 Retention times and MS parameters for the 56 analytes in MRM mode

2.1.2 色谱条件的优化

由于不同类型药物的极性差异较大，化合物中的羧基等官能团易与金属离子形成络合物，造成峰拖尾等现象。本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)4种流动相体系的分离效果。结果显示，乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)作为流动相时各化合物的峰型较好，56种药物的MRM总离子流图如图1所示，因此选择乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)为流动相进行后续试验。

a-除氯霉素类外的其他药物；b-氯霉素类图1 奶粉基质中56种药物的MRM总离子流色谱图Fig.1 Total ion current chromatograms of the 56 drugs in the milk powder by MRM

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 样品加水量的考察

由于奶粉样品是粉末状的，直接用有机溶剂对其进行提取时会呈现包块状态，需要先加入一定量的水将其溶解，再加入提取溶剂进行提取。实验考察了1、3、5、10、15、20 mL加水量对目标药物回收率的影响(图2)。结果表明，当加水量为1 mL时，奶粉与水溶解效果较差，有细小的包块颗粒；当加水量为3 mL时，回收率小于60%的药物数量较多；当加水量为5 mL时，回收率在60%～120%的药物的数量最多；当加水量分别为10、15、20 mL时，大部分药物的回收率逐渐降低。因此，1 g奶粉样品中加入5 mL水时，各个药物的提取效果最佳。

图2 不同加水量对奶粉中56种药物回收率的影响Fig.2 Effects of different water additions on the recoveries of the 56 drugs

2.2.2 提取溶剂的考察

由于药物种类多、极性差异不同，选择适合多数药物的提取溶剂尤为重要。本实验考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷对56种药物提取效率的影响。结果显示，奶粉样品基质主要成分为蛋白质、糖类和脂肪，样品中的脂肪等易溶于甲醇及乙酸乙酯，干扰较重，不利于后续净化过程；使用二氯甲烷作为提取溶剂时，样品的乳化现象较严重；乙腈具有较好的沉淀蛋白质作用，当乙腈作为提取溶剂时对目标药物的提取效果较好。因此在后续实验中，选择乙腈作为提取溶剂。

由于部分目标药物带有含氮基团，具有一定的弱碱性，在提取溶剂中加入适量甲酸可提高它们的提取效率。本实验考察了0.1%、0.5%、1%、2%、5%甲酸乙腈对56种化合物的提取效率。结果显示，喹诺酮类药物的回收率随着甲酸浓度的增加逐渐增加，甲酸体积分数为1%时提取效率最好；磺胺类药物的回收率随着甲酸浓度的增加逐渐降低，不加甲酸时提取效率最好。由于奶粉样品基质中蛋白质含量较高，酸化乙腈可更好地沉淀蛋白质。综上，选择0.1%的甲酸乙腈为进一步研究的提取溶剂。

2.2.3 净化剂的选择

奶粉中蛋白质和脂肪含量较多，会随着目标药物一起被提取出来，净化处理会降低这些物质对目标物的干扰。目前常用的净化材料有N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)粉、C18粉。PSA结构中含有2个氨基，属于氨基吸附剂，通过氢键能去除样品中的有机酸、脂肪酸、糖类等；C18是一种非极性、广谱性的净化剂，可有效去除样品提取液中的非极性杂质[23]。根据基质中的易干扰组分，本实验选择PSA粉、C18粉考察其净化效果。

2.2.3.1 PSA添加量的优化

在C1840 mg的固定条件下，对比20、30、40、50、60 mg PSA对目标药物的影响。由图3可知，PSA为50 mg时，回收率在60%～120%的药物数量最多；PSA<50 mg时，回收率<60%的药物数量较多；PSA为60 mg时，回收率>60%的药物数量增加，但是超过120%的药物数量较多。因此采用PSA为50 mg进行后续实验。

图3 PSA用量用量对奶粉中56种药物净化效果的影响Fig.3 Effects of amount of PSA on the purification efficiencies of the the 56 drugs

2.2.3.2 C18添加量的优化

在PSA 50 mg的固定条件下，对比20、30、40、50、60 mg C18对目标药物的影响。由图4可知，C18为20 mg时，回收率<60%的药物数量较多；C18为30 mg时，回收率在60%～120%的药物数量最多；C18>30 mg时，回收率超过120%的药物数量较多。因此采用C18为30 mg进行后续实验。

图4 C18用量对奶粉中56种药物净化效果的影响Fig.4 Effects of C18 on the purification efficiencies of the 56 drugs

2.2.4 基质效应

基质效应(matrix effects，ME)是指检测系统检测样品时，处于分析物周围的所有非分析物质对分析物参与反应的影响[1]。评估基质效应可以用空白基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率之比来衡量。ME<1时，表示存在基质抑制效应；ME=1时，表示不存在基质抑制效应；ME>1时，表示存在基质增强效应。结果表明，43%药物的ME<0.9%，呈现为基质抑制作用；36%药物的ME为0.9%～1.1%，基质效应相对不明显；21%药物的ME>1.1%，呈现为基质增强作用。因此，本实验采用基质匹配标准曲线，可降低对目标药物基质效应的影响。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系、相关系数及检出限

56种药物在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数(r)≥0.999 07。采用空白样品加标方式考察56种药物的检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)，检出限为0.06～5.47 μg/kg，定量限为0.21～16.53 μg/kg，符合筛查要求(表2)。

2.3.2 回收率和精密度

加标回收率及精密度结果如表2所示。56种药物的加标回收率范围为61.3%～129.8%，RSD为0.090%～7.171%。本方法具有较高的准确度和精密度，可用于测定奶粉样品中的多种农药残留。

表2 56种待测物质的线性方程、相关系数、检出限、定量限、加标回收率和RSD(n=6)Table 2 Linear equation, correlation coefficients, LODs, LOQs, spiked recoveries and RSDs of the 56 analytes (n=6)

续表2

2.4 实际样品的测定

采用建立的方法测定了11批次市售成人奶粉样品中56种违禁药物残留，单批样本中检出药物种类3～7种，共检出药物10种(表3)，分别为恩诺沙星、磺胺多辛、甲氧苄啶、磺胺嘧啶、氟苯尼考、地西泮、异戊巴比妥、三唑仑、咪达唑仑、洛硝哒唑，其中恩诺沙星、磺胺多辛、甲氧苄啶、磺胺嘧啶未超过我国兽药残留的最高限量标准(磺胺类总量、恩诺沙星限量均为100 μg/kg，甲氧苄啶为50 μg/kg)。氟苯尼考在动物泌乳期禁用，有2批次样品有微量检出；我国镇静类药物仅有地西泮允许作治疗用，但不得在动物性食品中检出，本次实验样品中有10批次样品有微量残留；此外，样品中检出的异戊巴比妥、三唑仑、咪达唑仑、洛硝哒唑等目前还没有相关的检测及限量标准要求。由此可知，成人奶粉中残留的违禁药物较多，可能会给消费者的健康带来影响。今后需要相关部门加强监管，严格控制奶粉生产过程中的原料及添加剂安全，提高产品质量，保障消费者的“舌尖安全”。

表3 奶粉样品中药物的含量 单位：μg/kg

3 结论

本文利用液相色谱-三重四级杆串联质谱MRM模式，建立了奶粉中56种违禁药物残留的高通量检测方法。56种药物线性良好，检出限为0.06～5.47 μg/kg，定量限为0.21～16.53 μg/kg；加标回收率为61.3%～129.8%，RSD为0.090%～7.171%。该方法前处理操作简便，基质匹配标曲法定量准确，通过对实际样品的测定，证实了该方法具有高效、准确、重复性好的优点，可以广泛应用于奶粉样品中多种违禁药物快速筛查和定量检测，为市场监管产品质量的风险评估提供技术支持，也可为今后制定相关检测标准提供方法依据。