蒸制工艺对酒女贞子外观性状和主要成分的影响△

徐文娟，董海鹏，韩婷，屈文佳，李春帅，魏锋，李向日*，林瑞超

1.北京中医药大学 中药炮制研究中心/北京市中药品质评价重点实验室，北京 102488；2.国家知识产权局 专利局复审和无效审理部，北京 100088；3.中国食品药品检定研究院 中药民族药检定所，北京 100050

女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实，始载于《神农本草经》，列为上品，具有滋补肝肾、明目乌发之效[1-2]。女贞子经酒蒸或酒炖为酒女贞子后，其“形如女贞子，表面黑褐色或灰黑色，常附有白色粉霜，微有酒香气”[1]。传统认为[3]，女贞子生品性凉，可清肝明目、滋阴润燥，用于治疗肝热目眩、阴虚肠燥便秘等症，如菊女饮（《辨证录》）、女贞汤（《医醇剩义》）等。酒制后，补肝肾作用增强且其寒凉之性得以缓解，多用于腰膝酸软、须发早白、目暗不明等症，如二至丸（《医方集解》）、缪仲淳乌发明目丸（《续名医类案》）等。酒女贞子在现代临床应用广泛，可用于治疗慢性肝炎、高脂血症、更年期综合征、老年性便秘、不孕、心悸等，亦可作为放化疗辅助药物。

女贞子主要活性成分为萜类、苯乙醇苷类和黄酮类化合物，具有抗骨质疏松、抗肿瘤、保肝、调节免疫、降血糖、调血脂、抗炎、抗菌、抗衰老等作用[4]。现代研究发现，酒制对脂溶性萜类齐墩果酸、熊果酸含量无明显影响[5]，但对环烯醚萜类与苯乙醇类等化合物含量影响显著。酒制的24 h 内，环烯醚萜类化合物除女贞酸含量逐渐升高后趋于稳定外，特女贞苷、女贞苷、橄榄苦苷等含量均有降低的趋势[6-7]；除松果菊苷、毛蕊花糖苷等含量下降外，多数苯乙醇类化合物含量呈现上升或先升后降的趋势[5,7-8]。女贞子酒制后，其药理作用也发生了明显的变化，抗骨质疏松、抗炎抑菌、升白、调节免疫等作用增强，并减缓了肠道的蠕动，可缓解生品所致滑肠泻下的不良反应[9-10]。可见，女贞子与酒女贞子在化学成分和药理作用上存在明显差异。然而，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版中女贞子、酒女贞子均以特女贞苷作为含量测定的指标成分，且含量限度一致，均为“含特女贞苷（C31H42O17）不得少于0.70%”，难以体现女贞子酒制的炮制原理，亦难以全面评价酒女贞子的质量，无法保证临床有效用药。

评价中药质量的方法主要包括传统鉴别法和有效成分含量评价法，两者各有利弊。前者主观性强，难以统一标准，后者因忽略性状，常被指责为“唯成分论”，结合两者优势，才能更加全面客观评价中药质量。课题组前期对女贞子药材的性状与化学成分之间的关系进行研究，发现女贞子成分与其颜色、百粒质量等存在一定关系[11-12]。本研究基于前期研究，进一步探究酒女贞子在蒸制过程中，其外观性状（颜色、白霜）及特女贞苷、红景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、芦丁6 个成分含量的变化规律（图1），并对《中国药典》2015 年版酒女贞子含量测定的方法提出建议。

图1 女贞子中6个成分结构

1 材料

1.1 仪器

Waters 2489 型高效液相色谱仪；Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；FW-100型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；KQ-600DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AG 型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；PANTONE 色卡C 版（深圳千通彩色彩管理有限公司）。

1.2 试药

对照品特女贞苷（批号：111926-201404，纯度：97.3%）、红景天苷（批号：110818-201708，纯度：98.8%）、芦丁（批号：1000-200702，纯度：90.5%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品松果菊苷（批号：16102103，纯度≥98.0%）、毛蕊花糖苷（批号：16102103，纯度≥98.0%）均购自成都普菲德生物技术有限公司；对照品酪醇（批号：J0621RA13，纯度≥98.0%）购自上海源叶生物技术有限公司；甲醇为色谱纯；娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。

女贞子药材（产地：河南，批号：022170501）由河北橘井药业有限公司提供，经北京中医药大学李向日教授鉴定为木犀科植物女贞Ligustrum lucidumAit.的干燥成熟果实。

2 方法

2.1 不同蒸制时间酒女贞子样品的制备

参照《中国药典》2015 年版及《北京市中药饮片炮制规范》2008 年版中的炮制方法对女贞子药材进行炮制，分别蒸制2、6、12、16、20、24 h，干燥，得不同蒸制时间的酒女贞子样品。

2.2 蒸制时间对酒女贞子外观性状的影响

观察酒女贞子颜色及白霜随蒸制时间的变化，并结合PANTONE色卡对其颜色进行评价。

2.3 蒸制时间对酒女贞子中主要成分的影响

按照课题组前期研究建立的方法，对酒女贞子中特女贞苷、红景天苷、酪醇、松果菊苷、毛蕊花糖苷、芦丁的含量进行测定[11]。

2.3.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）为流动相，梯度洗脱（0～15 min，4%A；15～35 min，4%～6%A；35～60 min，6%～15%A；60～100 min，15%～20%A；100～130 min，20%～40%A）；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长分别为230、350 nm；进样量为10 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 分别取对照品特女贞苷、红景天苷、酪醇适量，精密称定，加入甲醇稀释至特女贞苷、红景天苷、酪醇分别为0.33、0.31、0.36 mg·mL-1的混合对照品溶液（a）；分别取对照品松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷适量，精密称定，加入甲醇稀释至松果菊苷、芦丁、毛蕊花糖苷分别为0.31、0.30、0.31 mg·mL-1的混合对照品溶液（b）。

2.3.3 供试品溶液的制备 取女贞子样品中粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理30 min。再次称定质量，用70%甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 样品含量测定 自制酒女贞子样品中粉按2.3.3 项下方法制备供试品溶液，按2.3.1 项下色谱条件测定，计算样品含量。

3 结果与分析

3.1 蒸制时间对酒女贞子外观性状的影响

不同蒸制时间的酒女贞子样品见图2，性状结果见表1。由图2及表1可知，在蒸制过程中，随着蒸制时间的延长，女贞子的颜色逐渐加深，酒蒸0～6 h，其颜色由棕褐色转变为黑褐色，并伴有少量白霜；酒蒸6～12 h，颜色变为灰黑色，白霜明显可见；酒蒸12～24 h，酒女贞子性状无明显变化；自制酒女贞子均微有酒香气。有研究表明，白霜为齐墩果酸，酒制可使女贞子质地酥脆，促进齐墩果酸的溶出，从而增强疗效[13]。女贞子酒蒸过程中颜色加深可能与其发生美拉德反应有关，有研究发现，女贞子在酒炖24 h内，其多糖及多数环烯醚萜类化合物含量呈下降趋势[5-7]，水溶性低分子糖含量在酒炖0～24 h内呈升高趋势而后显著下降[5]，5-羟甲基糠醛（5-HMF）含量逐渐升高且在酒炖20 h后含量升高最为明显[5]，表明女贞子酒制过程中多糖及环烯醚萜苷类化合物水解产生的低分子糖可能参与美拉德反应，从而导致饮片颜色加深。另外，环烯醚萜苷类化合物水解产生的苷元可进一步发生氧化、聚合等反应，亦有可能导致女贞子酒制过程中颜色发生变化[14]。综上，女贞子酒蒸过程中颜色变化可能与其多糖及环烯醚萜类成分存在一定关系，后续可量化颜色指标，对此进一步研究[15-16]。女贞子酒蒸6～24 h 后，其外观性状符合《中国药典》2015 年版酒女贞子性状标准，表明酒女贞子的蒸制时间应不少于6 h。

表1 不同蒸制时间酒女贞子性状

图2 不同蒸制时间的酒女贞子样品

3.2 蒸制时间对酒女贞子中主要成分的影响

女贞子及不同蒸制时间的酒女贞子样品6 个成分含量测定结果见表2 及图3。由表2 及图3 可知，随着蒸制时间的延长，裂环环烯醚萜类成分特女贞苷含量显著下降，苯乙醇类成分红景天苷、酪醇含量随之升高，与文献[5-7]报道结果一致，这与特女贞苷水解生成红景天苷，红景天苷进一步水解转化为酪醇有关[6]，其转化规律见图4。亦有研究表明，红景天苷、酪醇含量的升高与女贞苷G13、女贞苷、女贞次苷、oleopolynuzhenide A、oleonuezhenide 等环烯醚萜类化合物的水解有关；另外，随着时间的延长，苯乙醇类成分松果菊苷、毛蕊花糖苷含量也呈现下降的趋势；黄酮类成分芦丁含量较少且略有下降[17]。

图3 酒女贞子蒸制过程中6个成分的含量变化

图4 特女贞苷的水解

表2 不同蒸制时间酒女贞子的含量测定结果（n=2） %

目前，已明确酒女贞子蒸制过程中特女贞苷、红景天苷、酪醇三者间的转化关系；结构上，松果菊苷仅比毛蕊花糖苷多1 分子葡萄糖，表明松果菊苷在女贞子蒸制过程中可能发生水解生成毛蕊花糖苷；松果菊苷、毛蕊花糖苷受热水解可生成羟基酪醇、咖啡酸等化合物，芦丁受热水解可生成槲皮素。采用SPSS 23.0 统计分析软件对酒女贞子蒸制过程中6 个成分含量的变化趋势进行相关性分析，结果见表3。从表3 中可以发现，6 个成分含量变化呈强相关，表明6 个成分间在含量变化趋势上存在相关性。目前未见女贞子产生不良反应的相关报道，其经酒制后疗效增强与有效成分含量升高关系密切。由于红景天苷、酪醇含量变化趋势成极显著正相关（Y=0.1X+0.05，r=0.849）且酪醇含量较低，而红景天苷含量较高、活性强，具有保肝、保肾、保护神经系统、保护心血管、抗衰老[18]等作用，与酒女贞子的功效一致，说明红景天苷是酒女贞子的主要药效成分，故建议将红景天苷作为酒女贞子含量测定的指标成分。

表3 酒女贞子蒸制过程中各成分含量变化的相关性分析

《北京市中药饮片炮制规范》2008 年版规定，酒女贞子蒸制时间为15～24 h[19]。本研究表明，女贞子酒蒸6～24 h 后，其外观性状符合《中国药典》2015 年版酒女贞子性状标准，同时，红景天苷含量随酒蒸时间的增加而不断升高，进一步证实《北京市中药饮片炮制规范》2008 年版对女贞子酒蒸时间规定的科学性与合理性。

4 讨论

本实验基于前期研究基础，研究酒女贞子在蒸制过程中外观性状及特女贞苷、红景天苷、酪醇等6 个成分含量的变化规律。结果表明随蒸制时间的增加，酒女贞子颜色逐渐加深，酒蒸6～24 h的样品符合《中国药典》2015 年版酒女贞子性状标准，蒸制时间超过12 h 时，酒女贞子的性状不再发生明显变化。6 个成分除芦丁含量略有下降外，红景天苷、酪醇的含量呈升高趋势，特女贞苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量呈现下降趋势，可见，酒女贞子与女贞子间成分含量差异显著。而《中国药典》2015年版并未对女贞子及酒女贞子的含量测定方法及限度标准进行区分，难以体现女贞子酒制的炮制原理。因此，有必要重新建立酒女贞子含量测定的方法，从而规范炮制工艺、提升饮片质量。关联各成分含量变化趋势，发现每2 种成分含量变化均成强相关（P＜0.01），由于红景天苷含量相对较高、活性强，且本课题组前期研究发现，各批次女贞子及酒女贞子中特女贞苷的含量差异较大，故建议用红景天苷替换特女贞苷作为酒女贞子含量测定的指标成分。

传统中医理论以药物的外观性状认知药性，而药物的功效则是对药性的具体体现，现代中药理论多以药效物质基础即化学成分组成与含量确定药物的作用[20]，古今分别通过外观性状和化学成分说明药物的药性、作用，可见，药物的外观性状与其内在成分存在一定相关性，通过炮制，药物的外观性状达到古人要求的同时，其内在成分也会发生相应转化，从而使得药物发挥作用的侧重有所不同。女贞子生用以“清虚热”，酒制后则用以“补肝肾”。本研究发现，女贞子在酒制过程中外观性状、内在成分均发生了显著变化。目前，对于女贞子炮制过程中成分转化机制的研究较多，关于其外观性状变化研究及外观性状变化与内在成分间关联研究的报道则相对较少。通过文献研究发现，女贞子酒制过程中颜色变化可能与其受热发生美拉德反应有关，美拉德反应广泛存在于食品加工及中药炮制的过程中，其反应过程主要为还原糖等羰基化合物和氨基酸等氨基化合物之间经缩合、聚合等反应生成类黑精等褐色物质，是一种非酶褐变反应，可导致食品或中药色泽、香味等发生变化[21]。多糖、环烯醚萜苷类化合物水解产生的小分子糖可为美拉德反应提供丰富的底物，环烯醚萜苷水解生成的酚类化合物可增强体系酸性，从而加快美拉德反应的速度[21]。此外，环烯醚萜苷类化合物水解产生的苷元可发生氧化、聚合等反应，亦有可能导致女贞子酒制过程中颜色发生变化。综上表明，女贞子酒蒸过程中的颜色变化与其多糖、环烯醚萜苷类等成分相关，后续可将颜色指标量化，与多糖、环烯醚萜苷类等成分含量及美拉德反应理化参数进行相关性分析，进一步阐释女贞子酒制的炮制机制。