基于网络药理学和分子对接探究三拗片治疗急性支气管炎分子作用机制△

滕龙飞，陈佳丽，周庆伟，王镓

1.河南中医药大学 第一临床医学院，河南 郑州 450046；2.河南中医药大学 第一附属医院 呼吸内科，河南 郑州 450000；3.河南中医药大学 基础医学院，河南 郑州 450000

急性支气管炎发病率较高，部分可迁延发展为慢性支气管炎、肺气肿、慢阻肺等多种慢性肺系疾病，加重患者及社会负担。三拗片（SAP）为《太平惠民和剂局方》中三拗汤的加味方，在三拗汤基础上加入生姜，由君药麻黄、臣药苦杏仁、佐药生姜及使药甘草4 味中药构成，具有宣肺解表、降气平喘之功效。生姜具有解表散寒、温肺镇咳、温中止呕的功效，因此加强了原方温肺散寒的功效，并能调和方中麻黄对胃肠道的刺激。SAP剂型为片剂，具有易于服用，方便携带、贮藏保管等特点，因此临床应用较多。中医临床研究发现，SAP 对于风寒型急性支气管炎有较好的疗效[1]。陈麒等[2]研究表明，SAP对风寒袭肺证急性支气管炎患者的咳、痰、喘三大主症具有明显的改善作用，且无明显不良反应，其中痊愈占22.50%，显效占51.25%。SAP 治疗儿童急性支气管炎疗效明显，不良反应少[3]。中药治疗疾病具有多成分、多靶标、多通路的特点，网络药理学的出现使得方药作用于人体的机制研究更具整体性和系统性[4]。本研究采用网络药理学方法，探讨SAP治疗急性支气管炎作用机制及其物质基础。

1 材料与方法

1.1 SAP的主要化学成分及靶点检索

利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php），根据药代动力学吸收、分布、代谢、排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME）参数筛选口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18的SAP潜在活性成分及相应的靶点，通过UniProt数据库将靶点蛋白转换为基因名，最终得到SAP 潜在活性成分的靶点基因，建立数据集。

1.2 急性支气管炎靶点基因获取

以“Acute bronchitis”为关键词，在GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）数据库中检索，获得与急性支气管炎相关的基因，重复基因仅保留1个。

1.3 SAP治疗急性支气管炎潜在作用靶点预测

通过Venny 2.1工具，将药物潜在活性成分靶点与疾病靶点相映射，最终得到药物-疾病共同靶点，即为SAP作用于急性支气管炎的预测靶点。

1.4 成分-靶点网络构建

利用Cytoscape 3.6.1 软件构建成分-靶点网络，其中节点（node）代表SAP 活性成分、预测靶点，边（edge）代表SAP活性成分与靶点相互作用关系。选取度（degree）和介数中心性（betweenness）大于平均值的化合物用于分子对接。

1.5 PPI网络构建及核心靶点筛选

将SAP 治疗急性支气管炎的作用靶蛋白导入STRING 11.5（https://string-db.org/）数据库，根据拓扑分析靶蛋白相互作用关系，并利用Cytoscape 3.6.1构建PPI网络，根据度值大小筛选排名前5的靶点作为核心靶点，用于分子对接。

1.6 基因富集分析

运用DAVID 6.8 对共同靶点所涉及的基因功能和相关通路进行富集分析，并将其结果可视化。

1.7 分子对接

将1.4 项下主要活性成分通过TCSMP 数据库下载MOL2 格式文件，通过AutoDockTools 1.5.6软件加氢后作为配体保存成pdbqt 文件；通过PDB 数据库下载1.5 项下核心靶点PDB 格式文件，利用PyMOL 软件删除水和配体，通过AutoDock 软件加氢后作为受体，保存成pdbqt 文件，利用AutoDock Vina 进行分子对接，筛选结合能最低的结构为最优结构。

2 结果

2.1 SAP活性化合物及潜在靶点筛选

筛选出SAP 活性化合物共124 个，共预测靶点103 个；其中麻黄有效成分23 个、苦杏仁有效成分19个、甘草有效成分92个、生姜有效成分5个。

2.2 急性支气管炎潜在靶点预测

检索GeneCards、OMIM、DrugBank数据库，剔除重复靶点后共获得急性支气管炎潜在靶点863个。

2.3 SAP治疗急性支气管炎潜在作用靶点

将SAP化合物靶点和急性支气管炎靶点取交集，共得到103 个共同靶点，即SAP 治疗急性支气管炎潜在作用靶点，见图1。

图1 SAP和急性支气管炎靶点韦恩图

2.4 成分-靶点网络构建

利用Cytoscape 3.6.1 软件构建出成分-靶点网络，筛选出活性化合物7 个，度值从大到小依次为槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、木犀草素（luteolin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、柚皮素（naringenin）、芒柄花黄素（formononetin）、甘草查耳酮A（licochalcone A），见图2。

图2 SAP治疗急性支气管炎的成分-靶点网络

2.5 PPI网络构建

PPI 网络构建结果见图3，共得到103 个节点、942条边，平均节点度值为18.3，根据度值大小排名前5的核心靶点为细胞肿瘤抗原p53（TP53）、蛋白激酶B1（Akt1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A（VEGFA），度值分别为59、56、52、50、48。

图3 SAP治疗急性支气管炎PPI网络

2.6 GO及KEGG富集分析

共富集得到GO 生物学过程575 条、细胞组分54 条、分子功能85 条。以P＜0.05 为筛选条件，选取排名前10 的GO 条目绘制气泡图，见图4，KEGG前10 条通路绘制气泡图，见图5。其中在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路、TNF信号通路、流感、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、FoxO 信号通路、Toll 样受体信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、百日咳、p53信号通路、核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体信号通路等方面靶点富集较为集中。

图4 SAP靶点的GO富集分析

图5 SAP治疗急性支气管炎靶点的KEGG通路富集分析

2.7 分子对接

分子对接结果显示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黄素、甘草查耳酮A结合能均小于-5 kcal·mol-1（1 kcal·mol-1≈4.182 kJ·mol-1），均能较好地与急性支气管炎靶蛋白结合，具体结合能信息见图6。以上7 个活性化合物与Akt1 结合能的均值为-8.3 kcal·mol-1，是5个靶蛋白中最小值，因此Akt1 可能是SAP 治疗急性支气管炎的核心靶点。β-谷甾醇分子对接不能与靶蛋白残基形成氢键，故排除，与Akt1 结合最好的为木犀草素，其次是槲皮素，分子对接模式见图7。

图6 SAP活性成分分子对接结合能热图

图7 Akt1与木犀草素、槲皮素的分子对接

3 讨论

急性支气管炎是外界抗原感染所致的支气管黏膜炎症，发作以咳嗽、咯痰、喘息为特征，西医临床多从抗感染、止咳、平喘、祛痰等对症治疗为主，其治疗方法单一且不良反应多，急性期迁延不愈转为慢性支气管炎更为难治[5]。中西医结合治疗急性支气管炎越来越得到认可，大量研究证实了SAP 对于急慢性支气管炎具有较好的临床疗效及安全性，相较于单纯西医治疗，能够明显缩短病程、减少药物不良反应、提高免疫力、降低复发率[6-10]。本方源于《太平惠民和剂局方》中三拗汤，三拗来源于制法特点[11]：1）麻黄不去根、节。发汗而不过汗，麻黄茎

在上属阳，根在地下属阴，正如肺之宣发肃降，一宣一降而复肺气。2）杏仁不去皮、尖，留尖主发散，连皮主涩汗，也为发中有收。3）甘草不炙，取其补中有发。本方在三拗汤基础上加入生姜1 味，加强了原方温肺散寒、温胃止呕之功。

研究显示，急性毛细支气管炎的气道炎症细胞多为中性粒细胞，其对于机体防御和炎症修复至关重要，而Akt1 又是中性粒细胞表达的重要亚型，在细菌感染或中性粒细胞被激活时下调，Akt1 的下调可减少中性粒细胞、单核细胞的炎症反应，因此SAP 中的活性化合物可能通过下调Akt1 起到抗炎作用[12-14]。木犀草素和槲皮素能够显著地抑制促炎性细胞因子TNF-α、IL-6 及IL-1β，表明木犀草素和槲皮素具有良好的体外抗炎效果[15]。槲皮素还是一种广谱抗菌不易耐药的植物抗生素[16-17]。山柰酚能够通过抑制肺组织促炎因子核转录因子-κB（NF-κB）、IL-1β、TNF-α表达，对急性肺损伤具有保护作用。β-谷甾醇具有良好的抗炎及免疫调节作用[18]。研究显示，β-谷甾醇可防止肺组织气道炎症的发生[19]。柚皮素能通过NF-κB 显著抑制炎症细胞及介质的释放，减轻脂多糖诱导的肺部炎症[20]。芒柄花素可增加小鼠淋巴细胞数量及细胞因子的释放，进而调节免疫力[21]。甘草查耳酮A 可阻断细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）/NF-κB 来抑制炎症因子的表达，保护急性肺损伤小鼠[22]。PM2.5 触发的呼吸系统炎症可表现为VEGFA 显著上调[23]，分子对接结果发现，槲皮素、木犀草素、山柰酚等可能通过调控VEGFA改善气道炎症。

通过GO 生物学过程富集分析发现，SAP 治疗急性支气管炎可能涉及凋亡过程、炎症反应、细胞增殖、信号转导等生物过程，在急性支气管炎的治疗过程中起到关键作用。通过KEGG 通路富集分析发现，SAP 主要活性成分靶点可能参与了PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、流感、MAPK信号通路、FoxO 信号通路、Toll 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、百日咳、p53 信号通路、NOD 样受体信号通路，在急性支气管炎的治疗中发挥作用。人体免疫激活后，T 细胞分化释放IL-6、TNF 等促炎因子进行免疫[24]。抑制HIF-1α可以降低TNF-α和白细胞介素的表达，表明HIF-1α对促炎因子的分泌起关键作用。各种Toll 样受体可调节病毒复制，进而影响病毒的发病[25]。

综上所述，SAP 治疗急性支气管炎的有效成分可能是槲皮素、山柰酚、木樨草素、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花黄素、甘草查耳酮A 等，这些成分可能作用 于TP53、Akt1、IL-6、TNF、VEGFA 等 靶点，通过PI3K-Akt、TNF、流感、MAPK、Toll样受体、HIF-1等多条信号通路，共同参与抗炎、平衡细胞因子、免疫调节、抗病毒、抑菌而起到治疗作用。本研究利用网络药理学方法初探SAP 治疗急性支气管炎的机制，但缺乏动物及体外细胞实验验证预测结果，具有一定局限性，有待进一步研究。