基于HPLC指纹图谱的白芍及酒白芍比较分析△

杨艳玲，刘彩凤，黄嘉怡，杨海菊，李花花，杜守颖，白洁

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

白芍始载于《神农本草经》，为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根，性微寒，味微苦、酸，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等功效[1]。现代研究表明，白芍所含的化学成分有单萜类、三萜类、黄酮类、鞣质、多糖等化合物[2]，具有抗炎、镇痛、保肝、抗氧化等多种药理作用[3-6]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版白芍项下收载了炒白芍、酒白芍2 种炮制品，炒白芍长于养血敛阴，酒白芍长于缓急止痛、缓和酸寒之性[7]。宋代《扁鹊心书》中首次出现白芍“酒炒”炮制[8]，一直沿用至今。与炒白芍相比，酒白芍的炮制工艺有更多的影响因素，如黄酒用量、浸润时间等。《中国药典》2020 年版规定，白芍酒炒时每100 kg 饮片的黄酒用量为10～20 kg，但并未规定具体的工艺参数，如温度、时间等。酒白芍炮制工艺的常用评价指标为芍药苷含量，但不同研究者筛选出的最佳炮制条件不完全相同[9-10]。酒炒会使芍药苷含量降低，也会使其他成分如多糖、苯甲酸等的含量发生变化，从而影响白芍的药效[11-12]。只以芍药苷作为指标性成分往往过于单一，难以反映中药整体成分群的变化。因此，对酒白芍整体质量进行评价，比较酒炒前后的变化，有利于酒白芍的质量控制及炮制工艺的研究。

指纹图谱具有整体性、模糊性的特点，中药成分复杂，采用指纹图谱技术可以充分反映中药中化学成分的整体状况，适合中药整体质量控制，同时结合指标性成分含量测定和出膏率，有利于从多指标角度比较生品与炮制品的区别[13-14]。白芍药材主要为栽培品，主产于安徽亳州、四川中江、浙江磐安和山东菏泽[15-16]。为了比较白芍酒炒前后的变化，且考虑到白芍多以水煎液入药，本实验选择安徽亳州、四川中江、浙江磐安3 个主产地的白芍样品，建立了白芍及炮制得到的酒白芍水煎液的指纹图谱，对其进行相似度评价。芍药苷是白芍中的主要活性成分，所以同时选择芍药苷含量作为评价指标，结合炮制前后出膏率变化，对其进行系统的质量研究。

1 材料

1.1 仪器

U3000型高效液相色谱仪（DAD检测器、CM 7.2色谱工作站，赛默飞世尔科技中国有限公司）；QE-200 型高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；BSA 224S型电子分析天平、BT 125D型电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；JM-B10002型电子天平（余姚市及纪铭称重校验设备有限公司）；HH-6型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康达圣科技有限公司）。

1.2 试药

对照品芍药苷（批号：110736-201842，纯度：97.4%，中国食品药品检定研究院）；水为娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

白芍及酒白芍均由亿帆医药股份有限公司提供，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根及炮制品，详细信息见表1。

表1 白芍及酒白芍来源

2 方法与结果

2.1 酒白芍的制备

依据《中国药典》2020 年版标准，取白芍样品，加黄酒拌匀，闷透，置炒制容器内，用文火炒至规定的程度时，取出，放凉[1]。每100 kg白芍用黄酒15 kg，文火炒至微黄色。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷对照品11.14 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成质量浓度为445.60 μg·mL-1的对照品母液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取白芍（或酒白芍）3.0 g 于500 mL 的圆底烧瓶中，加水200 mL，100 ℃加热回流65 min，用2 层300 目尼龙纱布滤过后放冷，滴加去离子水调整体积至200 mL，取滤液10 mL 离心10 min（10 000 r·min-1，离心半径为5.79 cm），过0.45 μm滤膜，即得。

2.4 HPLC指纹图谱的建立

2.4.1 色谱条件 色谱柱：InertSustainSwiftTMC18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，3%A；5～25 min，3%～9%A；25～40 min，9%～11%A；40～55 min，11%～12%A；55～70 min，12%～18%A；70～90 min，18%～34%A；90～100 min，34%～47%A；100～115 min，47%～95%A）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：15 μL。

2.4.2 指纹图谱处理方法 将数据以cdf.的格式导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件，对前8 min 的色谱峰进行剪切，采用中位数法，时间窗宽度为0.1 min，进行全谱峰匹配，计算相似度。

2.4.3 精密度试验 按照2.3 项下方法制备供试品溶液1 份（B15），按照2.4.1 项下色谱条件，连续进样6 次进行测定，图谱按照2.4.2 项下方法处理。结果显示，白芍与酒白芍的相似度均为1.000，剔除芍药苷色谱峰的影响后，白芍与酒白芍的相似度均为1.000。以芍药苷为参照，各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.07%，相对峰面积RSD 均小于2.52%，说明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 按照2.3 项下方法制备供试品溶液6 份（B15），分别测定，图谱按照2.4.2 项下方法处理。结果显示，白芍相似度均大于0.999，酒白芍相似度均大于0.995，剔除芍药苷色谱峰的影响后，白芍相似度均大于0.995，酒白芍相似度均大于0.964。以芍药苷为参照，各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.06%，相对峰面积RSD 均小于3.78%，说明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验 按照2.3 项下方法制备供试品溶液1 份（B1），分别在0、2、4、8、12、24 h 测定，图谱按照2.4.2 项下方法处理。结果显示，白芍与酒白芍相似度均大于0.999，剔除芍药苷色谱峰的影响后，白芍相似度均大于0.996，酒白芍相似度均大于0.999。以芍药苷为参照，各共有峰的相对保留时间RSD 均小于0.06%，相对峰面积RSD均小于2.81%，说明样品在24 h内保持稳定。2

.5 指纹图谱相似度分析

2.5.1 指纹图谱的采集和共有模式的建立 将15批白芍药材及酒白芍的数据按照2.4.2 项下方法进行处理，系统根据多批次样品色谱图的共有模式生成对照图谱R，经标定有8 个共有峰，结果见图1～2，其中8 号色谱峰为芍药苷。由于芍药苷色谱峰峰面积过大，而其他峰峰面积均较小，为了避免芍药苷贡献率太高，掩盖峰面积较小的峰的差异而导致分析结果的误差，因此相似度评价中剔除了芍药苷色谱峰的影响。为方便下文数据分析及表达，将芍药苷色谱峰编号为8，其余峰按照从左至右顺序进行编号。

图1 白芍药材HPLC指纹图谱

图2 酒白芍HPLC指纹图谱

2.5.2 白芍和酒白芍相似度评价 利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012版）软件分别生成白芍药材和酒白芍对照图谱，比较各样品与相应对照图谱的相似度，结果见表2，各批次白芍药材与其对照图谱之间相似度为0.988～0.999，各批次酒白芍与其对照图谱之间相似度为0.991～0.999。剔除芍药苷色谱峰的影响后再次计算相似度，结果见表3。各批次白芍药材与其对照图谱之间相似度为0.915～0.995，各批次酒白芍与其对照图谱之间相似度为0.951～0.998，相似度均大于0.9，说明整体上相似性良好。

表2 白芍及酒白芍指纹图谱相似度

表3 白芍及酒白芍指纹图谱相似度（剔除芍药苷后）

2.5.3 白芍与酒白芍HPLC 指纹图谱比较 通过指纹图谱相似度软件评价白芍和酒白芍，两者之间色谱峰相似度较高，区别较小，对照图谱比较相似度达0.999，见图3，表明酒炒对于整个峰群影响较小。因为芍药苷的出峰时间适中，峰面积较大且稳定，因此以芍药苷为参照峰，计算相对峰面积，结果见表4。通过8个共有峰相对峰面积比较可知，炮制后6号峰较生品有所下降，7号峰基本不变，其余的峰相对峰面积均有不同程度的增加。

图3 白芍及酒白芍HPLC对照图谱比较

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面积分析（,n=15）

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面积分析（,n=15）

注：以白芍中芍药苷峰面积为1计算。

2.6 指标性成分定量分析

取白芍和对应的酒白芍，按照《中国药典》2020 年版一部[1]中白芍项下芍药苷的含量测定方法制样，并进行测定，计算炮制前后芍药苷的含量变化，结果见表5。由表5可知，白芍中芍药苷质量分数为2.20%～5.28%，平均质量分数为3.23%；酒白芍中芍药苷质量分数为2.52%～3.21%，平均质量分数为2.94%。含量变化平均值为-0.29%，说明酒炒会影响芍药苷的含量。

表5 白芍及酒白芍中芍药苷质量分数及变化 %

2.7 水提液出膏率分析

按照2.3 项下方法分别制备白芍炮制前后的供试品溶液，置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，60 ℃真空干燥箱中干燥3 d，取出冷却后准确称取质量，按照公式（1）和（2）分别计算出膏率和出膏率变化幅度，结果见表6。

由表6 可见，不同批次样品之间出膏率差别较大，15批白芍药材的平均出膏率为19.73%，整体出膏率为13.53%～24.50%，其中B13 出膏率最高，B15 出膏率最低；炮制后15 批酒白芍的平均出膏率为20.98%，整体出膏率为15.89%～26.82%，其中J8出膏率最高，J3出膏率最低。

表6 白芍及酒白芍出膏率及变化幅度 %

比较白芍炮制前后出膏率的变化可知，第1、11、13、14 批样品炮制后出膏率下降，且第11、13批下降较明显；其余批次均有不同程度的升高，其中第8、15 批样品出膏率升高幅度较大。出膏率变化幅度为-18.57%～36.38%，剔除第1、11、13、14批的异常值后平均变化幅度为2.45%。

3 讨论

3.1 流动相体系及检测波长的选取

本实验分别考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸的流动相体系，由出峰数、柱压及指纹图谱整体的分离度，最终选择乙腈-0.1%磷酸水作为流动相；选择210～300 nm 的波长对供试品溶液进行扫描，发现在230 nm 条件下，基线相对平稳，响应值高，峰数量较多，分离度较好，因此选取230 nm作为检测波长。

3.2 白芍及酒白芍质量评价

本实验通过建立白芍酒炒前后的HPLC 指纹图谱，进行相似度评价，发现白芍与酒白芍之间相似度较高；含量测定结果表明，白芍酒炒前后指标性成分芍药苷质量分数变化为-2.13%～0.49%，整体呈下降趋势。白芍酒炒后出膏率整体呈上升趋势，第1、11、13、14 批炮制后出膏率反而降低，原因可能为不同产地及批次白芍之间本身存在质量差异，以及药材净制过程中去细根、去皮操作不完全一致等。这也提示在白芍的生产加工过程中应注意规范化，以保证药材质量。

3.3 白芍炮制前后的成分变化

从整体上分析，白芍炮制前后对芍药苷含量影响较大，由指纹图谱相对峰面积结果可知，峰1 炮制后相对峰面积有不同程度的升高，可能原因为酒润、炒制过程中增加了该成分的溶出[17]；峰6炮制后相对峰面积有所下降，可能原因为炒制及煎煮过程中该成分受到破坏，及转化为其他成分等[18]。白芍的主要成分为芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等，本实验结果中，白芍酒炒后芍药苷的含量大部分降低，少数升高。芍药苷的含量有很多影响因素，如炮制温度、储存方式等。刘亮镜等[17]研究表明，白芍酒炒之后芍药苷含量略有升高，原因可能为乙醇促进了芍药苷的溶出。但大部分研究者发现，白芍酒炒会降低芍药苷、苯甲酸的含量，增加芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷的含量[19-20]。芍药苷在炮制过程中可能会转化为芍药内酯苷和苯甲酰芍药苷，芍药苷受热不稳定，炒制过程中易被破坏；而苯甲酸是白芍中的有害成分，炮制后含量减少，因此筛选最佳炮制工艺，有利于提高白芍质量[21-22]。

本研究建立的方法稳定可行，可以系统地对白芍酒炒前后整体成分群的相似性和差异性进行比较，同时成分的变化也是炮制前后药理作用研究的基础，也可为其他药材炮制的研究提供参考。