基于分子标记的江西省芝麻地方种质遗传多样性分析

王郅琪，孙 建，梁俊超，赵云燕，颜廷献，颜小文，危文亮，乐美旺，*

(1.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025； 2.江西省农业科学院 作物研究所/江西省油料作物生物学重点实验室/国家油料改良中心南昌分中心，江西 南昌 330200)

芝麻(SesamumindicumL)是唇形目胡麻科胡麻属的一个栽培种，其种子富含油脂和蛋白质，营养价值高[1]；而且其耐旱、耐贫瘠，适应性和种植范围较广，在世界各地都有种植。芝麻是我国传统特色油料作物，在河南、安徽、湖北、江西等全国大部分省份均有种植[2-3]。江西是我国四大芝麻主产区之一，栽培芝麻品种丰富，有白芝麻、黑芝麻、黄芝麻和红芝麻等，其中，黑芝麻占江西省芝麻面积的60%以上。江西主要是红壤丘陵地形，各地均有种植芝麻的传统习惯，地方农家品种资源十分丰富。地方农家种质作为种质资源的重要组成部分，是广泛收集、鉴定和保存种质资源的重要来源。种质资源多样性评价是种质创新与利用的关键和基础性工作，其在表型、染色体、蛋白质(酶)和DNA等多个水平开展的遗传多样性研究是鉴定种质资源多样性的重要方法。

近年来，有较多基于表型性状对芝麻进行遗传多样性分析的研究，如崔彦芹等[4]利用相关分析、聚类分析和主成分分析等统计方法对河北省种质库收集的300份芝麻种质资源进行了遗传多样性分析。吕伟等[5]对189份山西芝麻种质资源的18个表型性状进行了遗传多样性分析。韩俊酶等[6]利用SPSS软件对山西省200份种质资源的13个农艺性状进行了遗传多样性分析，以促进种质资源的合理利用。俞信英等[7]利用表型性状探讨了浙江省沿海地区19份芝麻地方种质的遗传多样性分析。随着分子生物学技术的快速发展，随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphism DNA，RAPD)[8-10]、相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)[11-16]、简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)[17-20]等分子标记已广泛应用于芝麻种质资源遗传多样性研究，且已有较多报道。本研究基于“第三次全国农作物种质资源普查与收集行动”中收集的132份江西芝麻地方种质，在完成了表型性状遗传多样性分析的前提下，进一步应用SRAP和SSR分子标记技术对其进行分子水平的遗传多样性分析，研究结果将为优异种质资源挖掘与新品种选育提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为132份江西芝麻地方种质资源，主要是江西省所属市(县、区)的各地农家种质，由江西省农业科学院作物研究所收集、整理(表1)。

表1 江西省132份芝麻地方种质资源名称、编号与来源

续表1 Continued Table 1

续表1 Continued Table 1

续表1 Continued Table 1

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与质量检测

DNA提取和质量检测参照孙建等[21]的方法。每份种质选取50粒左右饱满健硕种子播于培养皿内，发芽7 d后取子叶与下胚轴作为材料，采用CTAB法提取基因组DNA，用RNaseA消除残留的RNA，用紫外分光核酸测定仪检测DNA浓度，在1%琼脂糖凝胶上电泳检测DNA质量；将DNA稀释到50 ng·μL-1，保存于-20 ℃冰箱备用。

1.2.2 SSR引物与PCR扩增

根据已经公开发表的文献资料，选取83对SSR引物对132份江西芝麻地方种质资源进行多态性引物筛选，最终共获得28对条带清晰且差异明显的引物(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用本实验室建立的SSR-PCR反应体系(10 μL)：50 ng·μL-1DNA 2 μL、10 μmol·L-1正反引物各0.6 μL、2Master Mix (包含Taq酶、Mg2+和dNTPs) 5 μL，加ddH2O至10 μL。SSR-PCR反应程序：94 ℃变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环；72 ℃ 10 min，12 ℃保存。SSR-PCR反应产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离和银染显影。

表2 SSR引物名称及其序列

1.2.3 SRAP引物与PCR扩增

选用正反引物共20条，引物序列均根据Li等[22]设计而成(表3)，由生工生物工程(上海)服务有限公司(Sangon Biotech)合成。SRAP的PCR反应体系参照孙建等[14]，PCR扩增程序参照Li等[22]。PCR反应产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离和银染显影。

表3 SRAP引物及其序列

1.3 数据统计与分析

经银染显影，分别统计SSR和SRAP的扩增条带，清晰且在同一位点的记为“1”，没有带的则记为“0”。参照Nei等[23]的方法，采用NTSYS-PC 2.10e分析软件，首先对数据进行标准化预处理，计算遗传相似系数(gentic similarity coefficient，GS)和遗传距离(genetic distance，GD)，然后采用非加权类平均法(unweighted pair-group method with airthmetic means，UPGMA)对SRAP与SSR数据进行聚类分析；使用Popgene软件，按种质的不同地理来源计算不同类群的遗传相似系数，并进行不同分区的聚类分析；其他数据分析采用Excel 2010完成。根据目标种质收集地点分布于江西省的6个地理位置进行划分。参考《芝麻种质资源描述规范化和数据标准化》中芝麻种皮颜色分类标准进行分类。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

统计了28对多态性SSR引物的扩增结果(表4)，获得265个DNA条带，每对引物扩增5～21条，平均9.46条；其中，多态性条带221条，比例为83.40%，每对引物扩增出1～21条多态性条带，平均7.89条。

表4 SSR和SRAP引物扩增的结果

SRAP引物扩增结果表明，20条正反引物随机组合的26对引物共扩增出601条DNA条带，每对引物扩增9～36条，平均23.12条；每对引物扩增出多态性条带2～23条，共扩增出268条多态性条带，平均每对引物扩增多态性条带10.31条。每对引物扩增的多态性比例为10.53%～80.00%，平均为44.59%。

2.2 总体遗传多样性和聚类分析

由表5可以看出，132份芝麻地方种质资源间的遗传相似系数(GS)介于0.598 2～0.960 7，平均0.813 5；遗传距离(GD)介于0.048 8～0.538 0，平均为0.230 9，遗传距离较近，表明江西省芝麻地方种质间的遗传多样性不够丰富，遗传基础较窄。从遗传距离和遗传相似系数来看，种质间遗传关系最远的是编号2019363114(吉安市峡江县金江乡金滩村)的种质与编号2018361089(上饶市鄱阳县双港镇马鞍山村)的种质(GS=0.598 2，GD=0.538 0)，这2个种质在地理位置上分别位于江西省的中南部和东部；遗传关系最近的是编号2018363519(井冈山市东上乡东上村)的种质和编号2019362072(丰城市石江乡下山村)的种质(GS=0.960 7，GD=0.048 8)，这2个种质所属区域分别位于江西省中南部和中北部。由地理位置来看，中南部与中北部接壤，所以该芝麻地方种质的遗传关系与地理来源距离有关联。

对132份芝麻地方种质进行聚类分析，结果(图1)表明，132份种质总体被分为3大类群。类群Ⅰ共122份材料，占总体材料的92.42%，表现为各个种质交叉混合聚集，将其进一步划分为9个类别，分别表示为A-I。A类有63份材料，且在地理位置上属于江西省北部、中北部和东部，即北部、中北部和东部的材料被优先聚为一类，地理分布较近的种质遗传差异小；B类包含40份材料，来自江西中北部、西部、中南部和南部，即此4个方位的种质被聚集为一类，且其种质之间的遗传差异小；C-I类包括19份材料，分别属于江西省的中北部、西部、中南部和南部，同B类一致，此4个地理位置聚类为一组。类群Ⅱ包含8份材料，分别位于江西省中南部和南部，这两个地理位置接壤而被聚集在一起。类群Ⅲ包括2份材料，属于中南部同一个市区的不同县，即地理分布较近被聚为一类。由此可见，地理来源邻近的江西芝麻地方种质遗传基础存在一定相似性而被聚集在一起，个别种质被聚类至分类明显的类群里，可能与地方种质发生自然变异或天然异交有关。

编号1～132同表1。

2.3 不同区域种质的遗传多样性分析和聚类分析

按地理来源不同，将132份江西芝麻地方种质资源分别划分为赣北、赣东、赣中北、赣西、赣中南和赣南共6个区域(表5)。赣北区域包括九江市的都昌县、武宁县、瑞昌市、修水县和永修县，赣东区域包括景德镇市的乐平市、上饶市的德兴市、横峰县、鄱阳县、万年县、婺源县、弋阳县、玉山县和鹰潭市的余江区，赣中北区域包括南昌市的进贤县和宜春市的丰城市，赣西区域包括宜春市的奉新县、上高县、樟树市、铜鼓县、萍乡市的芦溪县和新余市的分宜县，赣中南包括抚州市的崇仁县、黎川县、临川县、南城县、安福县、吉州区、井冈山市、青原区、万安县和峡江县，赣南区域包括赣州市的定南县、宁都县、全南县、瑞金市、兴国县和寻乌县。比较发现，赣北(GS为0.788 7～0.958 4，GD为0.051 1～0.273 4)、赣东(GS为0.735 6～0.946 9，GD为0.063 0～0.350 1)、赣中北(GS为0.767 9～0.909 9，GD为0.100 1～0.301 0)的遗传相似系数和遗传距离变化区间比较接近，而赣西(GS为0.616 6～0.923 8，GD为0.089 8～0.524 5)、赣中南(GS为0.620 1～0.930 7，GD为0.076 4～0.500 2)和赣南区域(GS为0.662 8～0.908 8，GD为0.103 2～0.447 1)的遗传相似系数和遗传距离变化范围比较接近。在6个区域中，遗传相似系数明显呈自北向南逐渐下降的趋势，赣北(0.867 1)>赣东(0.858 4)>赣中北(0.848 3)>赣中南(0.805 8)>赣西(0.796 3)>赣南(0.788 9)，即赣北和赣东的遗传多样性丰富度低于赣西、赣中南和赣南区域。

表5 132份芝麻地方种质资源的总体遗传多样性分析和按种质区域来源、粒色分类的遗传多样性分析

在此基础上，将6个区域的种质分别进行聚类分析。结果(图2)表明，根据种质间的遗传相似性程度不同，被聚类为不同数目的大小类群，类群中的种质又交错分类，各个种质聚为了多个小类群，这可能与江西芝麻地方种质自然变异或天然异交、系统选育而来[24]有关。综合上述各个区域种质的聚类结果，同一区域内种质间同样存在一定的遗传差异，这与地理距离远近无明显关联。

A，赣北地区；B，赣东地区；C，赣中北地区；D，赣西地区；E，赣中南地区；F，赣南地区。

不同地理来源的种质群体聚类分析结果(图3)表明，6个区域被明显分为两大类群，第一类群为赣北和赣东区域紧密聚在一起，这与前述的总体132份芝麻种质资源的聚类结果基本一致，表明这两个区域多数种质与种质之间的亲缘关系较近；第二类群主要为赣中北、赣西、赣中南和赣南区域种质群体，其中赣中南和赣南较为紧密聚在一起，然后依次与赣西和赣中北区域种质群体聚在一起。可见，江西芝麻地方种质资源的亲缘关系具有明显的地理区域特点。

图3 132份芝麻地方种质按6个区域划分的聚类结果

2.4 不同粒色种质的遗传多样性分析和聚类分析

根据种皮颜色不同，将132份芝麻地方种质资源划分为3个类型，分别为白芝麻、黑芝麻和其他粒色芝麻(包括黄色、褐色、黄褐色、红褐色等)。对粒色不同的3个类型种质遗传多样性进行比较，结果(表5)显示，白芝麻种质的遗传相似系数平均为0.812 5，遗传距离平均为0.230 9，黑芝麻种质的遗传相似系数平均为0.839 4，遗传距离平均为0.197 1；其他粒色芝麻种质的遗传相似系数平均为0.786 7，遗传距离平均为0.259 0。从遗传相似系数来看，白芝麻种质和黑芝麻种质的遗传相似系数比较相近，表明白芝麻种质和黑芝麻种质虽然是同一性状的不同表现型，但是这两类芝麻种质资源之间的遗传多样性丰富度相似。总体来看，这3个类型种质的平均遗传相似系数均偏高，表明组内各种质之间的亲缘关系较近。

根据遗传相似系数分析结果分别对3个粒色类型不同的种质进行聚类分析。结果(图4)表明，以赣中北为分界线，白芝麻种质分布在赣中北的西南方向居多，占73.91%；有较少的种质分布在赣中北的东北方向，占26.09%。以赣中北为分界线，黑芝麻种质中有66.22%来源于赣中北方位的东北方向，来源于赣中北方位的西南方向的种质较少，占33.78%。以赣中北为分界线，其他粒色芝麻种质有66.67%来源于赣中北方位的东北方向，只有33.33%来源于赣中北方位的西南方向。综上所述，虽然种质之间存在一定的流通，但不同粒色芝麻种质集中分布的地理方位存在一定的差异，这可能与芝麻种质自身因地制宜和地方选择性种植有关。

A，白芝麻种质；B，黑芝麻种质；C，其他粒色芝麻种质。

3 结论与讨论

SRAP标记具有操作简便、成本低、可靠性好、重复性高等诸多优点，已被应用到植物遗传图谱构建[22，25-26]、遗传多样性分析[27]、基因定位和比较基因组学[28]等诸多方面，但芝麻的SRAP和SSR标记开发与遗传多样性研究都起步较晚[18]。本研究利用26对SRAP引物组合对132份江西芝麻地方种质资源进行多样性分析，扩增得到DNA条带和多态性条带各601条和268条，多态性条带比例为44.59%，平均每对引物扩增位点为10.31个。该结果和前人[15，18，29]的研究基本接近，但是多态性条带占比与前人结果相比略低，而每对引物的扩增位点数与前人结果相比略高，这可能与芝麻地方种质资源自身遗传基础和所筛选引物多态性差异有关。随着新一代测序技术的发展，作为第二代开发出来的标记，SSR分子标记因其自身的序列在不同物种中长度、重复单位次数、突变情况和在染色体分布的差异，由此形成了等位基因的多样性[30]。鉴于SSR标记的诸多独特优点，如共显性、数量丰富、多态性高、成本低等，已在较多作物中被应用于群体分析[31-33]、DNA指纹图谱构建[34]、种质鉴定和辅助育种[35]、遗传图谱构建[36]、QTL定位[37]等研究。本研究利用多态性差异明显的28对SSR引物，在132份江西芝麻地方种质资源中扩增检测的DNA条带和多态性条带分别为265条和221条，多态性条带比例为83.40%，每对引物平均扩增到多态性位点7.89个。与前人利用SSR标记分析芝麻种质资源的遗传多样性结果基本相符合[38-39]。表明本研究所筛选的SRAP引物组合和SSR引物对可在本研究的供试种质中获得较好的扩增结果，能够准确反映不同引物在种质间的遗传特点和多态性差异，可用于进一步分析芝麻种质资源的遗传多样性。

芝麻种植历史悠久，来源不同的地方种质从不同农业生态区引进、交换，导致种质资源发生多向交流。因此，芝麻遗传多样性和遗传基础的研究结果存在一定差异[40]。本研究分别从不同地理来源和不同粒色类型出发，分析供试种质的遗传多样性和遗传距离。首先，132份江西芝麻地方种质间的遗传相似系数(0.598 2～0.960 7)和遗传距离(0.048 8～0.538 0)与前人用SRAP和SSR等分子标记对来源不同的芝麻种质资源多样性分析结果基本接近[18，20]，表明芝麻种质之间的遗传多样性比较匮乏。其次，按不同地理方位划分的6个区域，整体由北向南呈逐渐下降的趋势，西南方向芝麻种质的遗传多样性高于东北方向种质，与张艳欣等[29]用SRAP标记分析209份中国白芝麻核心种质多样性分析结果相似。且聚类结果也显示出赣北和赣东种质聚为一类，其余区域聚为一类，与总体聚类分析的结果基本一致，进一步说明供试种质的亲缘关系与地理位置分布存在一定的关联。这与孙建等[39]用SRAP和SSR标记对29个中国主要黑芝麻种质遗传多样性分析中的聚类结果吻合。此外，生产上江西芝麻主要集中在赣北、赣东和赣中北的鄱阳湖流域，品种流通相对频繁，商品种覆盖率较高，所以多样性相对不够丰富，相似系数较高。而赣南和赣中南地区地处山区，芝麻种植规模小，种子流通相对有限，商品种覆盖率较低，该区域种质资源的多样性较其他区域更为丰富。最后，按粒色分为白芝麻、黑芝麻和其他粒色芝麻3个类型，从遗传相似系数和遗传距离分析可见，其他粒色芝麻种质的遗传多样性较丰富，白色芝麻种质次之，黑色芝麻种质在3个粒色类型中遗传多样性丰富度相对较差，这可能与江西主产黑芝麻有关。江西省主要以种植黑芝麻为主，其种植面积和产量均占全国60%以上，所以黑芝麻种质间流通频繁，导致品种趋向单一化，遗传多样性不丰富；白芝麻种质种植面积低于黑芝麻，种质间流通相对不多，遗传多样性较黑芝麻略丰富；而其他粒色芝麻种质种植面积很小，种质间流通非常有限，几乎无商品化生产，其种质自身保留完整，导致其他粒色种质的遗传多样性高于白芝麻种质和黑芝麻种质。

本研究发现132份江西芝麻种质资源的遗传多样性总体较为匮乏，但分布在江西省西南部的遗传多样性比东北部的遗传多样性相对丰富，3个粒色类型中其他粒色芝麻种质遗传多样性最丰富，这为江西省芝麻种质资源的进一步收集保存提供了理论参考，今后的芝麻种质资源收集应该倾向于赣南地区和倾向于黑、白芝麻之外的其他粒色类型。