湖北枫杨水煎液诱导CIA模型大鼠滑膜细胞凋亡机制研究

陈 明 向 阳*

1.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000； 2.风湿病发生与干预湖北省重点实验室(湖北民族大学)，湖北 恩施 445000

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，以关节滑膜慢性炎症及关节的进行性破坏为主要特征，以对称性多关节炎为主要临床表现，常见关节处疼痛、肿胀，呈持续性、反复性发作[1-4]。若不及时治疗，最终可引起关节畸形，丧失关节功能。RA的发病机制并不十分明确，滑膜细胞增殖与凋亡失衡是目前研究的重要方向。RA滑膜细胞的增殖与炎性细胞浸润、血管翳形成、侵蚀软骨及骨组织损伤为主要病理特征，从而导致关节结构破坏、畸形及功能丧失[5]。有研究[6]发现，RA患者滑膜细胞增生明显，而细胞凋亡率显著减少，却并没有因过度增生出现过多的细胞凋亡，提示滑膜细胞的凋亡障碍可能是导致滑膜增厚的原因之一。有研究[7-8]表明，湖北枫杨(Pterocarya Hupehensis Skan，PHS)通过影响线粒体凋亡途径诱导RA滑膜细胞凋亡，本实验建立CIA模型大鼠，用湖北枫杨水煎液进行干预，进一步探讨枫杨对CIA大鼠膝关节滑膜凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠60只(200±20)g，购于武汉剑悦生物科技有限公司，许可证号为SCXK(辽)2015-0001。

1.2 药材与试剂 湖北枫杨树皮，采自湖北省恩施市清江河滩，经袁林副教授鉴定，为胡桃科Juglandaceae枫杨属Pterocary Kunth植物。甲醇、异丙醇、冰醋酸(武汉市中天化工有限责任公司)；BCA试剂盒、HRP标记的羊抗兔二抗(武汉科瑞生物技术有限公司)；雷公藤多苷片(浙江得恩德制药股份有限公司)；牛Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；大鼠IL-4、IFN-γ、TGF-β、IL-17AELISA试剂盒(酶联生物)；β-Actin 抗体、HRP 羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；Bcl-xl、Caspase-8(abcam公司)；TNFRⅡ抗体(美国CST公司)；RIPA裂解液、彩色预染蛋白质分子量标准(10-180kD)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、蛋白酶抑制剂(上海碧云天生物技术研究所)。

1.3 设备和仪器 酶标仪(Thermo公司)；电泳仪电源(北京六一生物科技有限公司)；包埋机(美国通用电气医疗集团)；石蜡切片机(Leica公司)；化学发光成像分析仪(美国通用电气医疗集团)。

2 实验方法

2.1 模型建立 60只大鼠适应性喂养1周，随机选取10只作为正常组，其余50只制作CIA模型。

2.2 动物分组 将造模成功的50只大鼠，随机分为5组，分别为模型组、雷公藤多苷组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，未造模的10只大鼠作为正常组。

2.3 给药方案 雷公藤多苷组大鼠予以 6.25 mg/(kg·d) 的雷公藤多苷混悬液灌服，枫杨低、中、高剂量组分别给予2.0 g/(kg·d)、4.0 g/(kg·d)、8.0 g/(kg·d) 的水煎液灌服，正常组、模型组灌服等体积的生理盐水，每组大鼠每天灌胃1次，连续灌胃28 d。

2.4 取材 灌胃28 d后，禁食禁水12 h，待麻醉成功，打开胸腔，用采血针于心尖搏动处取血，用于ELISA法检测血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。充分暴露大鼠双膝关节腔，髌骨处可见一层淡黄色光滑组织，即为滑膜组织，利用手术刀及手术镊小心对其进行剥离并分离。

2.5 一般情况 每7天测量一次体重、膝关节直径、并进行关节炎评分，用以评价关节炎症程度。关节炎评分按照以下标准：0分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足趾肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。

2.6 HE染色 将组织从多聚甲醛固定液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，经酒精脱水、二甲苯透明，明胶浸蜡及石蜡树脂等包埋成含有滑膜组织的石蜡块。蜡凝固后，从包埋框中取出，并进行修整。将修整好的蜡块置于切片机上切片，切片漂浮于摊片机温水上将组织摊平，用载玻片将组织捞起，放入烘箱中烤片。取出切片，置于自动染色机脱蜡染色，再用中性树胶封片。最后镜下观察，并进行病理学评分。关节组织病理学评分标准为：组织无病理学改变，记作0分；轻微炎症浸润记为1分；中度记为2分；重度，但无血管翳生成记3分；严重的炎症浸润，形成血管翳或软骨、骨侵蚀，记4分。

2.7 ELISA法 检测血清细胞因子水平 按照ELISA试剂盒方法检测血清TGF-β、IFN-γ、IL-17A及IL-4水平。

2.8 Western Blot法检测相关蛋白表达 提取滑膜蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，然后将各组蛋白煮沸，加入四分之一体积的蛋白上样缓冲液(5×)。取适量的样本，在凝胶中依次加入蛋白上样缓冲液(1×)，Maker，各组蛋白样本，蛋白上样缓冲液(1×)进行电泳。再将蛋白转移至PVDF膜上，用3%浓度的BSA封闭1h，加入不同的一抗进行孵育：TNFRⅡ(1∶1000)，Caspase-8(1∶1200)，Bcl-xl(1∶1000)。过夜之后取出，TBST溶液洗膜3次，每次10 min，放入二抗(1∶12000)，孵育2 h，TBST溶液洗膜3次。最后进行显色，ImageJ软件分析条带的灰度值，以内参β-acting作为对照，得到各目的蛋白的相对表达量。实验独立重复3次。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况 正常组大鼠精神状态较好，体重明显增加，皮毛顺亮，饮食正常，足部皮肤无红肿情况，活动自如。模型组大鼠体重增长较正常组缓慢，皮毛较为暗淡枯槁，活动量明显减少，足部皮肤发红肿起，关节活动受限。各治疗组大鼠关节肿胀程度均有所降低，饮食量略有增加，体重逐渐增长，足部皮肤情况也有所改善。

3.2 体重变化 与正常组比较，模型组大鼠体重增长缓慢。用药后，各治疗组大鼠体重均有所增加，枫杨中、高剂量组和雷公藤多苷组体重增长明显(P<0.05)，枫杨低剂量组在用药2周后体重明显增加(P<0.05)。如图1所示。

图1 大鼠体重变化情况

3.3 枫杨水煎液对CIA模型大鼠膝关节直径的影响 模型组与正常组相比，关节直径明显增大(P<0.05)，治疗1周后，各用药组与模型组比较，关节直径有所减小(P<0.05)，到第4周发现，关节直径明显减小(P<0.05)。与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组对大鼠关节肿胀的改善更为显著(P<0.05)。如图2所示。

图2 大鼠膝关节直径变化情况

3.4 枫杨水煎液对CIA模型大鼠关节炎指数的影响 模型组与正常组比较，有显著性差异(P<0.01)，且模型组数据上升，提示造模成功。治疗1周后，雷公藤多苷组和枫杨高剂量组与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，治疗2周以后，各治疗组与模型组相比，有显著性差异(P<0.05)。且与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组对关节炎指数的改善有显著效果(P<0.05)。如图3所示。

图3 大鼠关节炎指数变化

3.5 枫杨水煎液对CIA模型大鼠关节滑膜的影响 与正常组比较，模型组大鼠滑膜病理评分明显升高(P<0.05)，与模型组比较，各用药组病理评分明显降低(P<0.05)，与雷公藤多苷组相比，枫杨高剂量组改善病理方面更为显著(P<0.05)，如图4所示。镜下可见：正常组大鼠滑膜组织中无明显病理变化，模型组出现大量炎性细胞浸润，滑膜细胞增多，且呈现多层，达到5～6层甚至更多。各用药组与模型组相比，滑膜增生，炎性细胞浸润有所缓解，层数也有所减少，而枫杨高剂量组效果最为明显，如图5所示。

图4 滑膜组织病理评分注：模型组与正常组比较，*P<0.05；各用药组与模型组比较，#P<0.05；枫杨高剂量组与雷公藤多苷组比较，☆P<0.05。

3.6 枫杨水煎液对CIA大鼠血清炎性因子水平的影响 与正常组相比，模型组大鼠血清中 TGF-β、IL-4含量明显降低(P<0.05)，IFN-γ、IL-17A含量明显升高(P<0.05)；与模型组相比，各用药组大鼠TGF-β、IL-4水平明显提高(P<0.05)，IFN-γ、IL-17A显著降低(P<0.05)；与雷公藤多苷组相比，低剂量组对TGF-β含量的升高和IFN-γ的降低更为明显(P<0.05)，高剂量组对IL-17A水平的降低和IL-4的升高更为明显(P<0.05)。如图6所示。

A.正常组;B.模型组;C.雷公藤多苷组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组图5 CIA 大鼠膝关节滑膜 HE 染色切片(×20)

图6 血清炎性因子含量变化注：与正常组相比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与雷公藤多苷组比较，☆P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

3.7 枫杨水煎液对CIA模型大鼠凋亡相关蛋白表达的影响 与正常组相比，CIA大鼠TNFRⅡ、Bcl-xl的蛋白表达显著增加(P<0.05)，Caspase-8的表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较：雷公藤多苷组和枫杨低剂量组大鼠的TNFRⅡ表达明显降低(P<0.05)；枫杨中、高剂量组TNFRⅡ表达反而明显升高(P<0.05)；枫杨低、中、高剂量组Caspase-8蛋白表达显著增加(P<0.05)，且均显著高于雷公藤多苷组(P<0.05)；各用药组Bcl-xl蛋白表达均降低，其中枫杨低剂量组差异有显著性意义(P<0.05)；枫杨低剂量组Bcl-xl表达水平显著低于雷公藤多苷组(P<0.05)。如图7所示。

A.正常组;B.模型组;C.雷公藤多苷组;D.低剂量组;E.中剂量组;F.高剂量组

图7 各组大鼠凋亡相关蛋白表达灰度比值注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与雷公藤多苷组比较，☆P<0.05；与低剂量组比较，△P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

4 讨论

细胞凋亡有两个途径：内源性途径和外源性途径[9]。线粒体是发生内源性途径的重要细胞器，而细胞表面死亡受体是介导含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶-8(Cysteinyl aspartate specific proteinase-8，caspase-8)激活的外源性途径[10]。外源性途径中，死亡受体激活的起始Caspase是Caspase-8，Caspase-8可通过激活Caspase-3执行凋亡。另外，还能够切割细胞基质中的B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族成员Bid前体[11]，形成截断的Bid(tBid)，tBid可进入线粒体中，并促使Bax等蛋白产生寡聚反应，诱导细胞色素C(Cytochrome C，Cyt-C)，同时使凋亡诱导因子AIF及其他相关凋亡信号从线粒体释放，进而诱导细胞凋亡[12]。研究发现枫杨水煎液可使大鼠滑膜组织凋亡诱导蛋白Caspase-8表达增加，凋亡抑制蛋白Bcl-xl表达降低。结合前期研究结果，说明枫杨能够通过上调Capase-8并作用于Caspase-3和B细胞淋巴瘤-xl(B-cell lymphoma-xl，Bcl-xl)蛋白，引起Cyt-C和其他凋亡信号的释放增加，从而促进滑膜细胞凋亡。

肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor，TNFR)在免疫系统及相关疾病中发挥重要作用，包括Ι型(TNFRΙ)和Ⅱ型(TNFRⅡ)。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)可分别与TNFRΙ和TNFRⅡ结合，介导不同的生物学活性[13]。在正常生理情况下，TNF-TNFRs系统保持凋亡与增殖两方面功能的平衡，病理条件下，介导两条相反的信号通路，会破坏这种平衡，导致机体免疫环境与功能紊乱，引起滑膜组织增生与炎症，发生疾病。体外分别培养RA患者与正常人的成纤维滑膜细胞[14]，发现与健康人相比，RA患者的滑膜细胞增生是通过上调TNFRΙ，下调TNFRⅡ表达，来激活TNFR相关因子，导致核转录因子-κB(Nuclear factor-kappaB，NF-κB)进一步活化，阻碍细胞的正常凋亡，造成滑膜细胞过度增殖，组织增生。Blüml研究[15]发现，TNFRΙ是关节炎发生的主要原因，而同时存在的TNFRⅡ对关节炎有保护作用。TNFRⅡ胞内不存在死亡结构域[16]，但是能够募集肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receeptor associated factor 2，TRAF2)，激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和NF-κB信号通路，发挥抗炎作用。

实验结果显示，枫杨干预CIA大鼠后，低剂量组下调TNFRII，与雷公藤多苷作用相似；而中、高剂量则对TNFRⅡ有上调作用，与雷公藤多苷完全相反。枫杨对TNFRII明显的双向调节现象的机制与意义尚不清楚，但值得进一步研究。考虑到TNFRII对关节炎症的保护作用，推测中、高剂量枫杨通过上调TNFRⅡ表达，与TNFRΙ竞争TRAF2，从而促进滑膜细胞凋亡，同时抑制NF-κB信号通路上的炎症因子的释放，参与抗炎通路中的炎症反应过程。这一发现对选择枫杨治疗剂量具有重要参考价值。前期细胞实验结果显示，湖北枫杨可通过调控相关蛋白的表达，影响线粒体凋亡途径，从而诱导MH7A细胞凋亡。本研究对前期实验进行了延伸，在动物水平进行研究，证实在湖北枫杨对CIA大鼠滑膜细胞的凋亡具有促进作用，其机理可能是通过调节凋亡相关蛋白TNFRⅡ、Bcl-xl和Caspase-8的表达实现的。