小续命汤与桃红四物汤对大鼠脑缺血再灌注损伤的干预研究
2021-10-08陈双龙杨青素范瑞娟
陈双龙 齐 麒 杨青素 范瑞娟
贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025
脑血管疾病为临床常见病,其致残率和死亡率明显高于其他疾病,严重影响患者家庭生活水平,有研究者对中国31个省,20岁以上约48万的成年人做调查,显示其患病率为1.1148%,死亡率高达0.1148%[1],给整个社会发展带来沉重的经济负担。脑血管病成为当今人类主要关注的问题。中医认为,中风和瘀血是脑血管病的常见病理因素。小续命汤和桃红四物汤分别具有扶正祛风和活血除瘀的疗效,是治疗脑血管病的经典方剂。有研究[2]发现小续命汤治疗脑卒中可促进神经功能的恢复,桃红四物汤对神经元损伤改善效果显著[3]。但两方联合治疗同一种疾病的相关研究较少,本实验选取上述两方合用,对大鼠脑缺血再灌注损伤模型进行干预,观察两方的疗效差别及是否存在协同作用,以期为脑血管疾病的治疗提供新思路。
1 材料
1.1 实验动物 选取120只健康雄性SD大鼠,体质量(250±30)g,购自重庆腾鑫生物技术有限公司[许可证号:SCXK(军)2012-0011]。
1.2 实验药材 本实验药材均购自北京同仁堂(贵阳分店)。桃红四物汤《医垒元戎》:由桃仁、红花、熟地黄、白芍、当归、川芎组成,按原方比例浓缩成生药浓度为2.1 g·mL-1的水煎液。小续命汤原方见于(唐·孙思邈《备急千金要方》):由麻黄、桂枝、白芍、川芎、黄芩、杏仁、附子、甘草、人参、防己、防风、生姜组成以原比例配药制为水煎剂,用蒸馏水调药物浓度至1.5 g·mL-1。
1.3 实验试剂和仪器 TTC染色液(北京索莱宝科技有限公司,批号:T8170);MCAO拴线(北京西浓科技有限公司,批号:2634-50A4);4%多聚甲醛固定液(国药集团化学试剂有限公司生产,批号:20180112);PBS磷酸盐缓冲液(北京中杉金桥生物技术有限公司生产,批号:ZLI-9062);无水乙醇(江苏海兴化工有限公司,批号:GB678-90);苏木素染液(珠海贝索生物技术有限公司,批号:BA-4097);盐酸(成都市科龙化工试剂厂生产,批号:20180118);中性树胶(国药集团化学试剂有限公司,批号:20171009);重铬酸钾(成都市科龙化工试剂厂生产,批号:20180120);浓硫酸(成都市科龙化工试剂厂生产,批号:20180119);APES(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:ZLI-9001);CPBS(0.01 M PH6.0)(北京中杉金桥生物技术有限公司,批号:ZLI-9064);氯托洛宁(上海如吉生物科技发展有限公司,批号:180118);转轮式切片机(上海聚慕医疗器械有限公司,型号:徕卡-2016);全自动封闭式组织脱水机(常州市中威电子仪器有限公司,型号:TSJ-Ⅱ);包埋机(常州郊区中威电子仪器厂,型号:BMJ-Ⅲ);病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司,型号:PHY-Ⅲ);数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司,型号:BA400Digital);图像分析软件(美国Media Cybernetics公司,型号:Image-Pro Plus 6.0)。
2 方法
2.1 动物造模 按改良版Longa线栓法制备大脑中动脉阻塞1.5 h再灌注模型。实验前对大鼠适应性喂养7 d,术前禁食12 h,自由饮水。在大鼠予10%水合氯醛(0.3 mL·100 g-1)麻醉下,取仰卧位固定,颈前区备皮消毒后沿颈正中线切开3~4 cm,沿胸锁乳突肌内侧分离,找到右侧颈总动脉、颈内动脉,在颈总动脉近心端穿线结扎,远心端为松结。在颈总动脉分叉处暂时用微动脉夹夹闭。在颈总动脉两线间,距颈总动脉分叉处5 mm左右处将直径约0.23 mm的栓线插入颈总动脉后,取下微动脉夹。然后将栓线沿右侧颈总动脉插入颈内动脉,至大脑中动脉,插入(深度为18.5±0.5 mm)有阻力感时停止,将远心端的拴线系紧,缝合切口缺血1.5 h后抽出栓线,并给大鼠腹腔注射1 mL·100 g-1的限制性补液。术后各组采用Garcia JH评分为8~12分的大鼠即造模成功。(除假手术组除不插栓线外,余下步骤同模型组)
2.2 分组及给药 120只健康雄性SD大鼠,随机分为正常组、假手术组、模型组、小续命汤组、桃红四物汤组及两方合用组,每组20只,正常组和假手术组不予任何药物治疗正常喂养,模型组予等容量的生理盐水灌胃,小续命汤组、桃红四物汤组分别以小续命汤、桃红四物汤1 mL·100 g-1·d-1灌胃,而两方合用组先予小续命汤剂量(60 g·kg-1·d-1)治疗3 d,后再予桃红四物汤治疗。治疗至第7天时对各组大鼠进行神经功能评分后处死,取脑组织进行TTC染色和Nissl染色。
2.3 神经功能缺损 评分参照Garcia JH评分标准[4],从大鼠自主运动、前爪伸展功能、体态运动的对称性、身体双侧触觉、网屏抓取实验、双侧触须反应6个方面进行神经功能评分,记录并分别作比较。
2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑 (TTC)染色按照TTC染色试剂盒说明,将脑组织置于-20 ℃冰箱中冰冻25 min后取出,制成的冠状切片厚度约为2 mm,放入2%的TTC染液避光器皿中,置于37 ℃的恒温烘箱中25~30 min染色,15 min翻动一次使其均匀接触到染色液。染色后取出置于4%多聚甲醛中避光保存,固定24 h后将脑组织取出按切片顺序排列拍照,并使用Image-Pro-Plus 6.0分析软件测出脑梗死面积,再根据脑梗死体积百分率/%=脑梗死区体积/正常侧大脑半球体积×100%公式计算梗死体积。
2.5 Nissl染色 使用蒸馏水冲洗固定好的脑组织,换无水乙醇脱水,二甲苯溶液透明脑组织,石蜡包埋后再切片。使用APTES浸泡捞片后置于60 ℃烤箱中60 min使切片紧密黏附,切片按常规脱蜡至水,放入经预热至50 ℃的1%氯托洛宁水溶液中,置于56 ℃温箱中20 min染色,再用蒸馏水冲洗后酒精分化、脱水,镜下控制,以尼氏小体显示清晰为度,再使用无水乙醇脱水二甲苯透明2次后封片,在光学显微镜下观察尼氏体数量和大鼠大脑皮质缺血区进行拍照分析结果。染色后的尼氏小体可呈蓝紫色。
3 结果
3.1 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响 正常组及假手术组大鼠均未出现神经功能缺损表现(P>0.05);模型组大鼠神经功能评分显著降低(P<0.05)。与模型组比较,小续命汤组、桃红四物汤组、两方合用组大鼠神经功能评分显著提升(P<0.05),而两方合用组大鼠神经功能评分显著高于小续命汤组和桃红四物汤组(P<0.05),其中,桃红四物汤组的神经功能评分与小续命汤组比较组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠神经功能的影响
3.2 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积率的影响 正常组及假手术组大鼠脑组织切片无苍白梗死区;模型组有大范围白色梗死灶出现,经小续命汤、桃红四物汤、两方合用治疗后大鼠脑组织切片的苍白梗死面积均有不同程度的缩小。与模型组比较,小续命汤组、桃红四物汤组、两方合用组大鼠脑组织切片的脑梗死体积率均明显降低(P<0.05)。两方合用组的脑梗死体积率显著低于小续命汤组和桃红四物汤组(P<0.05),桃红四物汤组脑梗死体积率低于小续命汤组(P<0.05)。见表2、图1。
表2 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积率的影响
图1 TTC染色梗死面积大小的变化
3.3 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠存活神经元个数的影响 正常组与假手术组大鼠的神经元个数无明显差异(P>0.05),模型组大鼠的神经元个数显著减少(P<0.05);与模型组相比,小续命汤组、桃红四物汤组及两方合用组神经元存活个数显著增多(P<0.05),两方合用组神经元存活个数明显多于小续命汤组和桃红四物汤组(P<0.05),桃红四物汤组神经元存活个数又多于小续命汤组(P<0.05)。见表3,图2。
表3 小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注大鼠存活神经元个数的影响
4 讨论
缺血性脑血管疾病是因组织和器官血液供应不足,多机制、多环节相互作用,出现一系列复杂的结构损害和功能障碍的神经性疾病,细胞的凋亡坏死是脑缺血再灌注损伤的重要环节之一。研究[5]认为,及时恢复大脑缺血区域供血和减少神经细胞损害是治疗脑缺血再灌注损伤的关键。目前,对缺血性再灌注性脑损伤继发神经细胞损伤的发病机制并无定论,临床上治疗神经细胞损伤的药物也极度匮乏,因此,脑缺血再灌注损伤的病理机制、防治方法和药物的研究是近年来的热点所在。部分研究[6-7]发现小续命汤与桃红四物汤的有效成分均可改善脑缺血再灌注损伤的症状及神经细胞损伤的修复。
中医无脑血管疾病、脑缺血再灌注这个病名,根据相关文献记载可以参照中医之“中风和脑卒中”进行辨证论治。小续命汤出自孙思邈《备急千金要方》,具有祛风散寒、益气活血、通络等功效,临床上多用于急性脑梗死患者的治疗减少神经功能损伤,不良反应较少[8-9]。研究[10-11]表明,该方可改善脑缺血、增加脑组织血流量,及时恢复大脑缺血区域供血减少神经功能损伤,促进对突触生长及神经细胞本身的保护作用,有效恢复神经功能和修复脑组织而改善脑缺血再灌注损伤。桃红四物汤出自《医垒元戎》,由四物汤加桃仁、红花组成使之为治疗脑血管疾病活血化瘀的经典方剂。研究[12-13]发现该方能改善脑部血流动力学、抑制细胞的凋亡、调节神经血管修复因子及促进脑缺血再灌注损伤大脑神经细胞修复,减少脑梗死体积。
本实验使用小续命汤和桃红四物汤对脑缺血再灌注模型大鼠进行干预研究,结果发现通过小续命汤、桃红四物汤及两方合用的治疗,小续命汤组、桃红四物汤组及两方合用组均能改善神经功能缺损障碍,降低脑梗死体积率及增加大鼠大脑皮质顶叶区尼氏体数量,其中以桃红四物汤组的疗效为优,而两方合用组的疗效较单用小续命汤组和桃红四物汤组更为显著。在实验过程中,我们发现早期单用小续命汤较单用桃红四物汤治疗大鼠的死亡率更低,神经功能评分相对桃红四物汤组更高,推测可能与小续命汤具有扶正祛风的作用有关,更适合应用于急性期。