右美托咪定对大鼠心肌缺血再灌注损伤程度、氧化应激及TLR4/NF-κB 信号通路的影响

王志涛，刘德君

（郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450014）

近年来，心血管疾病的发生率正逐年增加，而在心血管疾病患者在接受治疗后心肌缺血再灌注（Myocardial ischemia-reperfusion，I/R）会造成心肌细胞的损伤，影响心功能，甚至加重病情，产生预后不良，严重影响患者的生活质量。目前I/R 造成损伤的机制还不明确，有研究报道[1]氧化应激反应可能参与了心肌损伤，心肌缺血后氧自由基清除能力降低，当血液再灌注后，短时间内大量的氧自由基，破坏细胞膜及线粒体功能。炎症反应[2]可能是另一个参与机制，氧自由基会引起白细胞表明特殊粘附因子的过表达，促进中性粒细胞黏附、聚集、浸润，形成微血栓，激活自身免疫系统，产生炎症反应，造成心肌损伤。Toll 样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路在炎症反应调控过程中发挥着重要作用[3]。右美托咪定（dexmedetomidine,Dex）是一类镇静镇痛药物，常用于临床麻醉。有报道[4]Dex在多种手术使用后能够调控机体炎症因子表达，拮抗氧自由基过量生成，保护组织器官，而Dex在I/R 运用较少。本研究通过Dex对大鼠I/R 后的心肌损伤、氧化应激、TLR4/NF-κB 信号通路的影响，为临床预防提供理论基础。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性成年健康SD 大鼠36只，体重250±20g，由我校实验动物中心提供，经我院动物伦理委员会批准。

1.2 试剂及仪器 大鼠肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB isoenzyme，CK-MB)、大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(Cardiac Troponin Ⅰ,cTn-Ⅰ)、大鼠N 端前脑钠素（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NTproBNP）、大鼠乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，Anti-TLR4、Anti-NF-kB p65 抗体购于艾博抗（上海）贸易有限公司，内参抗体及二抗均购于武汉博士德生物工程有限公司，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量检测试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司，电泳仪及凝胶成像系统购于美国bio-rad 公司，小型实验动物呼吸机，购于上海嘉鹏有限公司，可见分光光度计购于上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 动物分组及造模 将所有大鼠以随机数字表法随机分为3 组，每组12 只。实验组大鼠通过微量注射泵静脉泵注5μg/kgDex 预处理，损伤组和对照组泵注同等剂量0.9%氯化钠溶液预处理，1h 后进行造模，其中对照组只穿线不结扎。建立大鼠I/R 模型[5]：将大鼠固定于实验台，以乌拉坦1g/kg 腹腔注射对大鼠麻醉，切开气管连接呼吸机进行机械通气，沿着胸骨左缘切开第3～4 肋，行胸廓切开术以暴露心脏，对大鼠左冠状动脉前降支进行结扎，30min 后松开结扎线，血流再灌注120min。以心电图显示ST段下降50%以上或高耸的T段得到恢复为造模成功标准。造模成功后采集大鼠全身血，3000r/min 离心10min，取上清保存。

1.4 检测指标

1.4.1 心肌损伤标志物检测 采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组大鼠血清中CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌损伤标志物表达水平。上述操作严格按照ELISA 试剂盒说明书操作。

1.4.2 氧化应激检测 取各组大鼠的心肌组织，超声粉碎，1000r/min 离心取上清液，采用可见分光光度法检测各组SOD 活性及GSH、MDA 含量。上述操作严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.3 TLR4/NF-κB 检测 取各组大鼠的心肌组织，采用Western blot 法检测TLR4、NF-κB蛋白相对表达量，具体如下[6]：⑴提取蛋白。使用裂解液充分裂解心肌组织，16000×g 离心提取蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，后水浴锅煮，100℃，5min；⑵电泳。配置13%的浓缩胶，加入电泳缓冲液，将样本及蛋白Marker 加入凝胶孔中，80V 下电泳50min，待蛋白Marker 到达分离胶改用120V 电泳2h。⑶转膜。取下分离胶，按照2 层海绵、2 张滤纸、分离胶、PVDF 膜、2 张滤纸、2 层海绵顺序组装湿转系统，加入转膜缓冲液，低温100 V 湿转60min；⑷封闭。取出PVDF 膜浸泡在5%的脱脂牛奶中封闭，置于摇床室温封闭2h。⑸洗膜：参照蛋白Marker 剪下目的条带，TBST 洗膜3 次。⑹抗体孵育。先后加入一抗和二抗进行孵育，4℃摇床过夜。⑺显色。PCDF膜经ECL 发光液处理，暗室曝光、显影、定影、凝胶成像仪分析。

1.5 统计学方法对本次研究所得数据均采取SPSS22.0 统计软件展开分析。计量资料的表达形式为（），行独立样本t 检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 法。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH等心肌损伤指标比较 见表1。

表1 三组血清CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH 等心肌损伤指标比较

2.2 三组心肌组织SOD、GSH、MDA 等氧化应激指标比较 见表2。

表2 三组心肌组织SOD、GSH、MDA 等氧化应激指标比较

2.3 三组心肌组织TLR4、NF-κB表达水平比较实验组TLR4的表达量为0.81±0.09，损伤组TLR4的表达量为1.57±0.15，对照组的TLR4表达量为0.18±0.03，实验组和损伤组的TLR4表达量与对照组相比，明显较多（P<0.05），实验组的TLR4表达量与损伤组相比，明显较少（P<0.05）；实验组NFκB的表达量为0.56±0.06，损伤组NF-κB的表达量为1.21±0.11，对照组的NF-κB表达量为0.25±0.05，实验组和损伤组的NF-κB表达量与对照组相比，明显较多（P<0.05），实验组的NF-κB表达量与损伤组相比，明显较少（P<0.05）。见图1。

图1 三组TLR4、NF-κB水平比较

3 讨论

心血管疾病会引发心脏血流灌注减少，心脏供氧不足，导致心肌缺血缺氧，心肌细胞代谢异常，心功能衰弱，心脏无法正常工作，威胁患者的生命健康。治疗心肌缺血的治疗方法是血流再灌注，可恢复心脏供氧供血，但是据研究报道[7]缺血再灌注后患者会出现心律失常、心肌梗死面积扩大、心功能低下等更严重的损伤，甚至死亡，是心血管疾病临床治疗中的障碍。目前对抗I/R的主要方法有使用缺血预适应药物、抗氧自由基药物、抑制钙超载类药物、VEC 保护剂、抗氧化剂、传统中药等，有报道Dex 是一类新型的镇静镇痛药物与氧化应激、炎症反应密切相关[8]。

CK-MB 一类主要存在于心肌组织中的肌酸激酶亚型，能催化肌酸和ATP 生成磷酸肌酸和ADP，CK-MB 急性心肌梗死时3～4h 开始升高，12～28h达到高峰，可高度提示心肌损伤[9]。NT-proBNP 是BNP 激素原分裂后没有活性的N 末端片段，主要由心室肌细胞分泌，其在人体中水平较BNP 稳定，其升高主要与内毒素及炎症因子、心肌抑制因子及循环血容量有关，可反映心肌功能障碍，是临床检测心肌损伤标志物之一[10]。cTn-Ⅰ是一类调节钙介导的肌动蛋白和肌球蛋白相互反应的蛋白，主要分布在心肌中，急性心肌梗死发病后3～6 h 开始升高，14～20 h 达高峰，是心肌损伤高度特异度的诊断标志物之一[11]。LDH 一类NAD 依赖性激酶，有多种亚型，广泛存在于肾脏、心肌、骨骼肌中，心肌梗死后6～9 h 开始上升，36～60 h 达到高峰，因此可作为急性心肌梗死后期的辅助诊断指标[12]。研究结果显示 损伤组I/R 后，CK-MB、cTn-Ⅰ、NTproBNP、LDH水平均显著升高，而使用Dex的实验组CK-MB、cTn-Ⅰ、NT-proBNP、LDH水平均明显降低，说明I/R对心肌组织造成了明显损伤，而Dex 有助于预防心肌损伤，保护心肌组织。

心肌缺氧时可生成大量氧自由基，氧自由基能和细胞膜上的不饱和脂肪酸使膜脂质产生过氧化反应，进而导致心肌细胞的损伤，并形成脂质过氧化物，破坏细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜完整性，使胞膜的流动性、通透性增高[13]。SOD 能通过歧化反应催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢，是动物、植物、微生物体内重要的抗氧化剂，起到抗衰老、抑制心脑血管疾病、免疫系统疾病、慢性病、抗疲劳等作用，当机体存在过量氧化物时，SOD 被大量释放和激活，消除氧化物，可作为氧化应激反应的指标之一[14]。GSH 是三肽活性物质，分布于人体各个器官组织中，是细胞内重要的还原剂，防止由活性氧物质和重金属对重要细胞组分造成损害，能与其结合生成谷胱甘肽二硫化物，通过谷胱甘肽还原酶还原为GSH，调节维持体内氧化还原稳态，参与多种细胞增殖、分化及凋亡等生命活动的调控。当机体存在大量的氧自由基使，GSH 被大量消耗，含量降低[15]。MDA 是机体氧自由基的主要代谢产物，其含量直接反映了组织细胞的过氧化速率和强度，是氧化应激反应损伤的重要标志物[16]。本研究结果显示，大鼠I/R 后心肌细胞中的SOD活性增强，GSH 含量降低，MDA 含量上升，而使用Dex的实验组SOD 活性显著降低，GSH 含量显著升高，MDA 含量显著降低，说明I/R 能够造成大量氧自由基，使心肌细胞的氧化应激反应增强，而Dex 能够缓解心肌细胞的氧化应激，保护心肌细胞避免其的受到损伤。

在I/R 过程中，缺血的心肌细胞释放大量损伤相关分子模式（damage associated molecular pattems，DAMPs），参与免疫应答，TLR4 被激活，经过一系列的级联反应激活NF-κB 信号，促进下游炎症因子的释放，引发炎症反应，造成心肌组织损伤[17,18]。本研究结果显示研究结果显示损伤组I/R 后，TLR4、NF-κB水平均显著升高，而使用Dex的实验组TLR4、NF-κB水平均明显降低，说明Dex 是TLR4/NF-κB通路的负调控因子，有助于缓解I/R造成的炎症反应，降低心肌组织的损伤。

综上所述，Dex 能够有效的减少I/R对心肌的损伤，降低TLR4、NF-κB的表达，负调控其信号通路，缓解氧化应激反应，有助于心肌功能恢复，保护心肌。Dex的合理剂量是接下来需要研究的重点，低剂量可能达不到效果，高剂量可能会引起不良反应发生。