miR-224通过NK细胞调控皮肤淋巴瘤的作用及其机制研究

刘珂，秦玲，王娜，张艳芝，邓会阳，冯金彪

（河南科技大学第一附属医院 河南科技大学临床医学院血液科，中国 洛阳 471003）

原发性皮肤淋巴瘤（cutaneous lymphomas,CLs）是一类异质性的淋巴增生性恶性肿瘤，皮肤是淋巴瘤最常累及的器官[1]。65%的CL 属于成熟的T 淋巴细胞（皮肤T细胞淋巴瘤，CTCL），25%来源于成熟的B细胞（皮肤B细胞淋巴瘤，CBCL），其余部分为NK/T 皮肤淋巴瘤。当淋巴管扩散局限于皮肤而不涉及淋巴结、骨髓或脏器时，淋巴瘤主要被归类为皮肤性淋巴瘤[2,3]。据估计，每年CTCL的发病率为0.7～0.8/10 万，而CBCL的发病率约为0.3/10 万。流行病学显示，特定CL 亚型的患病率存在广泛的多样性。T细胞皮肤淋巴瘤主要来源于皮肤归巢性CD4+CD45RO+T细胞，具有浸润皮肤的潜能。CLs的发病机制复杂，其主要特征为恶性程度高，侵袭性强，预后较差等[4,5]。目前关于该类疾病的临床诊断较为困难，尤其在早期阶段，而临床治疗方式多为全身性化放疗,对提高患者总体缓解率和生产率十分有限。因此，基于皮肤淋巴瘤的分子靶向研究还具有广阔的空间和不可忽视的临床意义。

microRNAs（miRNA）是一类小非编码RNA，可在转录后水平行负调控靶基因，发挥着重要的生物学作用，如调节细胞的生长与增殖、细胞凋亡以及造血等功能[6]。由于miRNA 分子量较小，链较短，可在石蜡包埋组织中保存完好。因此检测特异性的miRNA表达丰度，对疾病的诊断、治疗以及预后具有巨大的潜能[7,8]。目前miRNA的功能及机制研究集中在B 淋巴细胞瘤，而对T 或NK细胞瘤中的研究较少[9]。NK细胞占淋巴细胞总数的10～15%左右，NK细胞异常活化参与CLs的发生发展，占非霍奇金淋巴瘤（NHLs）的10.5%。相关研究表明miRNAs在调控NK 淋巴瘤细胞增殖、凋亡和化疗敏感性中至关重要。

miR-224 是近年来研究较多，在大多数肿瘤中普遍失调的miRNA 之一，影响重要的细胞生物功能，具有临床诊疗和预后评估的临床价值[10]。大量的研究提示异常表达的miR-224 参与调节多种肿瘤的病理进程，如肝细胞癌，胰腺导管癌，卵巢癌，乳腺癌，肾癌，结肠癌，结肠癌和前列腺癌等[11,12]。miR-224与肿瘤的侵袭与转移密切相关，过表达的miR-224通过调控下游增殖、侵袭和迁移及抗凋亡相关的靶基因，包括CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2和MAPK1[13]。而在NK/T细胞淋巴瘤中，miRNA-224对细胞生物学行为的影响仍不清楚，因此明确miRNA-224的表达及生物调节功能对患者评估和靶向治疗提供科学依据。

本研究中，我们以miR-224 可能是参与调控NK 淋巴瘤细胞增殖和凋亡的关键分子为切入点，分析miR-224在促进NK/T细胞皮肤淋巴瘤发生发展的潜能是否具有相关性。通过组织qRT-PCR和体外细胞实验方法证实miR-224表达与皮肤淋巴瘤增殖及抗凋亡的关系；基于文献调研，进一步对筛选的靶基因进行验证，采用细胞体外转染实验结合生长曲线及凋亡流式细胞术等技术方法，确认MERK 信号通路是miR-224 下游调控的靶基因，是miR-224 参与调控淋巴细胞瘤增殖及抗凋亡的关键通路，明确miR-224 明确在皮肤淋巴瘤进展过程中的作用，旨在为皮肤淋巴瘤的诊断、预测和治疗靶点提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 RPMI-1640 培养基及胎牛血清购自美国Hyclone 公司。胰蛋白酶-EDTA 消化液购自Solarbio 公司。青霉素及链霉素购自美国Invitrogen 公司。BCA蛋白浓度试剂盒和Trizol 试剂购自美国Thermo scientific 公司;所有引物、miR-224 mimic和inhibitor及其阴性对照均由上海吉玛制药技术公司提供。CCK-8 试剂盒购自东仁化学科技有限公司。Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自R&D Systems 公司。MERK、p-MERK和GAPDH 抗体购自Abcan 公司。增强型化学发光（ECL）试剂盒（sc-2048）和PVDF 膜购自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 细胞系及临床样本 人正常NK细胞株ZYH168和人NK/T细胞株淋巴瘤细胞SNK6 购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。SNK6及ZY-H168细胞使用RPMI-1640 完全培养基于37℃，5% CO2培养箱恒温培养。收集本院皮肤科收治的38例NK T细胞皮肤淋巴瘤患者的淋巴瘤及其癌旁组织。

2 实验方法

2.1 细胞培养及转染 取处于生长对数期的SNK6，在RPMI-1640 完全培养基于37℃，5% CO2培养箱恒温培养。设计miRNA-224 mimic和inhibitor 进行脂质体转染实验，具体操作如下：转染前一天，将细胞分别接种到6 孔板中，接种密度每孔5×105个，当细胞密度达到60%～70%时，参考Lipo2000 说明书步骤，准备A、B 液，A 液：125μl Opti-MEM+5μl Lipo2000；B 液：125μl Opti-MEM+500 pmol miRNA-224 mimics/inhibitors 或其阴性对照，将A 液和B 液混匀，室温静止15min 后转入6 孔板中，6h 后根据细胞状态换成完全培养基。48h 后收集细胞，提取细胞总RNA，进行实时荧光定量PCR，检测转染效果。

2.2 细胞总RNA 提取及qRT-PCR 实验 将所有待测组织细胞样本收集至无酶EP 管中，加入适量TRizol 试剂（Invitrogen 公司）裂解,室温放置5min，加入200μl 氯仿,上下震荡15s 后,室温放置5min。12000rpm，4℃离心5min。将上层水相转移另一新EP 管，加入等量的氯仿混合后12000rpm 离心5 min。转移上层液体并加入等量预冷的异丙醇，-20℃放置30min 后离心，95%乙醇进行RNA 沉淀后，再使用75%乙醇清洗，加入适量DEPC水，充分溶解后-80℃备用。

用紫外分光光度计测定总的RNA 浓度，取A260/280 值在1.8～2.0 之间的样本。根据逆转录试剂盒说明书，取1μg的总RNA 进行逆转录得到cDNA。配制qRT-PCR 反应体系为20μl，反应条件为95℃预变性30s，95℃预变性5s，60℃预变性30 s，共40 个循环。以U6 作为对照。引物序列如下，miR-224 上游引物:5'-GAGCCCAAGTCACTAGT GGT-3'；miR-224 下游引物:5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游引物:5'-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3',U6 下游引物:5'-CGCTTCAGAATTTGCG TGTCAT-3'。各个样品做3 个复孔，对所提总RNA样本行miRNA-224 扩增，以U6 为内参，统计分析miRNA-224的相对表达量。

2.3 细胞增殖实验 使用CCK-8 试剂盒检测细胞生长曲线。具体步骤如下：将SNK6细胞接种于96孔板，调整细胞密度2000 个/孔，每组设3 个复孔。分别转染miRNA-224 mimic和inhibitor及其阴性对照，37℃恒温箱培养24h，48h和72h。加入10μl的CCK-8 继续培养2h 后，使用酶标仪检测在450nm 下的吸光度，统计分析数据。

2.4 细胞凋亡实验 取处于对数生长期的SNK6细胞，按2105 个细胞接种到6 孔板中，每组设置3个复孔。将培养过夜后，换成无血清培养液饥饿后进行转染实验，参照上述步骤。孵育48h 后，然后用不含EDTA的胰酶收集细胞，再用PBS 充分洗涤细胞两次。使用Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。分别在各组细胞中加入500μl的Annexin V，制成细胞悬液，然后加入5μl Annexin V-FITC 混匀，再加入5μl的Propidium Iodide 充分混合均匀,避光条件下于室温孵育10 min 后，用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。

2.5 Western blot 实验 将SNK6 接种于六孔培养板内，待细胞融合度达到80～90%时进行细胞转染实验，处理同上。转染48h 后，撤去血清，恒温箱培养2h 后提取细胞总蛋白。根据BCA蛋白定量试剂盒的操作说明书，采用标准蛋白BSA 做标曲，每组待测样品检测三次，通过紫外分光光度计检测562 nm 处的吸光值，根据标曲计算各组样品的蛋白浓度，调整后进行Western blot 检测MERK、p-MERK和GAPDH 内参蛋白，使用发光底物显影，凝胶成像系统观察、拍照，使用Image J 软件对各个目的条带进行灰度分析，统计目标蛋白的相对表达量。

2.6 统计学分析 所有细胞实验，每组至少设3 个平行样，每个实验重复3 次，从而保证数据的可信性。采用GraphPad Prism8.0 软件进行统计分析，所有实验数据通过平均值± 标准差（mean ± SD）的形式加以展示。组间显著性差异通过单因素方差分析进行检验。两组间比较采用配对t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 miR-224在皮肤淋巴瘤及NK 淋巴瘤细胞中高表达对皮肤淋巴瘤组织及细胞株进行实时荧光定量PCR 检测，结果显示：癌旁组织相比与皮肤淋巴瘤部位miR-224 比较，差异有显著性意义（P＜0.05）；与正常NK细胞株ZY-H168 相比，NK 淋巴瘤细胞株SNK6 中miR-224 高表达（相对表达倍数比为1：1.859，P＜0.05)。见图1。

图1 qRT-PCR 检测miRNA-224在皮肤淋巴瘤及NK 淋巴瘤细胞中的相对表达量。*P<0.05。

3.2 miR-224对NK 淋巴瘤细胞增殖的影响在NKTL细胞株SNK6 中，miR-224 mimic及inhibitor转染48h 后，通过实时定量PCR 检测所有相关实验样本中miR-224 变化。结果显示，相对于阴性对照组，miR-224 mimic 转染后miR-224水平升高，而在miR-224 inhibitor 转染组，miR-224 呈现低表达。提示miR-224 mimic和inhibitor 均成功转染，可以进行后续实验。见图2。

图2 qRT-PCR 检测miRNA-224 mimic和inhibitor 转染后相对表达量。**P<0.01。

为了阐明miR-224表达在皮肤淋巴瘤中的生物学机制，我们研究miR-224 上调或下调后会影响NK 淋巴瘤细胞的增殖和抗凋亡能力。miR-224 mimic、inhibitor及相关阴性对照物转染SNK6细胞后，采用CCK-8 法分别检测各组在24、48及72h的生长曲线。结果显示：与阴性对照相比，在SNK6细胞中，miR-224 mimic 增强了细胞增殖，而miR-224 inhibitor 则抑制了细胞增殖。这些结果表明，在转染48及72h，miR-224 正调控细胞生长增殖，与阴性对照组比较，具有统计学意义；而miR-224 inhibitor 组在转染48和72h 后，细胞增殖能力减弱，具有统计学意义（P<0.05）。见图3。

图3 miRNA-224 mimic、inhibitor对SNK6细胞生长曲线的影响

3.3 miRNA-224对NK 淋巴瘤细胞凋亡的影响通过细胞转染实验，将miR-224 mimic 转入SNK6细胞48 小时后，miR-224 模拟物转染组的细胞凋亡率(9.29±1.71）%，较阴性mimic对照组（18.27±2.01）%低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示miR-224 过表达可抑制SNK6细胞的凋亡。见表1。

表1 miR-224 模拟物和抑制剂对SNK6细胞凋亡的影响

miR-224 inhibitor 转染SNK6细胞后的48 小时，miR-224 抑制物 组细胞的凋亡 率（9.29±1.71）%，较阴性inhibitor对照组（18.27±2.01）%低，有统计学差异（P<0.05）。提示抑制miR-224的表达可促进SNK6细胞的凋亡。

3.3 miR-224 调控NK 淋巴瘤细胞的机制研究 近年来有关miR-224在肿瘤中的研究较多,对肿瘤发生的调节机制及作用靶点的探究中,有研究表明miR-224的靶基因主要是主要涉及参与肿瘤增殖、迁移、侵袭及凋亡，如CDC42、CDH1、PAK2、BCL-2及API-5 凋亡蛋白抑制因子5 等。有研究表明，MERK1 作为miR-224 下游靶基因参与增强多种肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力并且能够抵抗凋亡。因此我们进一步分析了外源性miR-224 是否影响NK 淋巴瘤细胞中MERK 信号通路。我们对转染了miR-224 模拟物和抑制物的SNK6细胞中的MERK1 含量及活性进行分析。见图4，Western blot 检测结果显示，与对照组相比，在miR-224模拟组中总MERK1的蛋白水平无显著变化，而p-MERK1 显著上调。此外，miR-224 抑制剂组下调p-MERK1蛋白表达，与抑制物对照组相比具有统计学意义。这表明miR-224 可能通过诱导MERK 信号通路促进皮肤淋巴瘤的发生发展。

图4 Western blot 检测miR-224 mimic及inhibitor处理SNK6 后，细胞内p-MERK、MERK、的表达情况。

我们进一步对各蛋白条带用软件进行灰度相对分析，结果可见图5。与对照组相比，miR-224 mimic 作用2 小时后可显著上调胞内p-MERK-1蛋白的表达水平（1.829±0.383 vs.1.000±0.261）,具有显著性差异（**P<0.01）。与对照组相比，miR-224 inhibitor 作用2 小时后可显著上调胞内p-MERK-1蛋白的表达水平（0.526±0.210 vs.1.000±0.324），差异具有统计学意义（P<0.01）。

图5 Western blot 灰度半定量分析miR-224 mimic及inhibitor对SNK6细胞的p-MERK1/t-MERK1与内参蛋白的灰度值比。**P<0.01。

4 讨论

miR-224在体外具有促进肿瘤增殖、侵袭迁移的作用，并与化疗反应相关。先前的报道显示，miR-224在绝大多数肿瘤中表达增高，可以促进细胞演进、增殖、分化，是肿瘤细胞增殖的正调节因子[13]。在本研究中，我们的体内外实验结果均表明，miR-224 可促进NK 淋巴瘤细胞的增殖、抑制凋亡，进一步研究发现可通过促进MERK 活性来增强细胞增殖和抗凋亡能力。miR-224 可作为NKTL皮肤淋巴瘤的肿瘤促进因子，因此皮肤淋巴瘤的诊断可以通过miR-224 进行预测。NFkB通路被认为是多种肿瘤重要的耐药机制，有丝分裂原活化蛋白激酶MAPKs 是一系列的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，它们在细胞增殖、分化、迁移、凋亡和炎症反应等多种细胞过程中发挥关键功能。MAPK 级联的激活需要四个序列元件，包括小GTPases（Ras和Rac 原癌基因）、MAPK 激酶激酶（Raf 或MEKK）、MAPK 激酶（MEK）和MAPKs。在哺乳动物中，MAPKs 家族主要包括c-Jun NH2 末端激酶JNK、p38 MAPK和胞外信号调节激酶ERK，每种MAPK具有不同的细胞定位、亚型和功能。在皮肤淋巴瘤发生发展中，MAPKs通路能够被许多不同的细胞外刺激激活，如细胞因子、生长因子、神经体液介质和机械应激[14]。异常活化的MERK 信号通路的抑制是皮肤淋巴瘤临床诊疗的重要靶点。

相关研究表明，MAPKs 信号通路在NK 淋巴细胞异常活化中起重要作用。有报道称MAPK通路受到miR-224的直接调控，其作用是促进肿瘤细胞增殖、侵袭，提高肿瘤细胞抗凋亡能力。这与我们的研究一致，miR-224在皮肤淋巴瘤组织中呈现低水平，且预后不良；进一步的体外实验表明，相较于人正常NK细胞系，miR-224在淋巴瘤细胞株SNK6 中呈现高水平。上调miR-224在SNK6细胞中的含量可促进细胞生长，而下调miR-224 将抑制SNK6的增殖。miR-224表达上调可激活MERKs 信号通路，这可能是决定皮肤淋巴瘤生物学行为的关键事件[15]。目前，关于miR-224在皮肤淋巴瘤中的作用研究有限，在miR-224 介导MERKs 信号对皮肤淋巴瘤的影响尚不清楚。

皮肤NK/T细胞淋巴瘤可分为原发性和继发性,具有高度的侵袭性,通常预后较差。据报道,MERK-1的磷酸化是miRNAs 一种重要的转录因子与肿瘤形成有关。然而p-MERK-1 介导的皮肤淋巴瘤发生仍然知之甚少。在目前的研究中,miRNAs 是根据先前报道的NKTL 生物学相关性筛选的。在一项比较YT细胞和正常NK细胞的研究中,miR-9和miR-189 被选为NKTL 中预期高表达和低表达的代表性miRNAs[16]。miR-146a和miR-155与外周血细胞中的LMP1/NF-kB 关系密切。此外，miR-106a 参与T细胞淋巴瘤和白血病的研究。这些发现表明，在NK/T细胞皮肤淋巴瘤中，某些miRNAs 可作为有效的抑癌或促癌因素[17,18]。在本文的研究中，我们发现AB23A 能够显著下调活化成纤维细胞内的MAPK和ERK 磷酸化，进一步发现核转录因子CREB的DNA 结合活性受到抑制，提示AB23A通过调控MER/ERK1/2/CREB 活化的信号通路减弱纤维化程度。

综上所述，miR-224在NK/T细胞皮肤淋巴瘤及NK 淋巴瘤细胞株SNK6 中高表达。体外研究显示，miR-224 高表达促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。深入研究miR-224 促进NK 淋巴瘤细胞增殖活化及抗凋亡的作用机制，结果提示miR-224 介导的MAPK 活性得到有效增加。miR-224 能够调控磷酸化MAPK的表达，进而促进NK 淋巴瘤细胞的增殖和抗凋亡活性，为抵抗NK/T细胞皮肤淋巴瘤治疗提供新的手段和思路。