Pooling PCR 技术常规用于HIV 感染状态诊断的可行性研究

唐翼龙，易志强，刘丽萍，张娜，靳廷丽，丁晨，胡强

（江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029）

在目前的艾滋病防制工作中，Western Blot 法（免疫印迹检测法）已成为一种广泛应用的、用于诊断HIV 病毒感染状态的方法。其检测程序为：抗体初筛、抗体复检、免疫印迹检测[1]。其中，筛查抗体的方法有酶联免疫法，化学发光法等；抗体确证的方法有普通免疫印迹法（WB）、条带/线性免疫印迹法(RIBA/LIBA)。这些经典的HIV 抗体检测方法为我国的艾滋病防制做出了重要贡献，但检测抗体的方法有其局限性[2]：对于早期HIV 感染病例，因为抗体还没有产生，使用此类方法去筛查血液样本，有漏检的风险[3]；在艾滋病病程晚期,因病人的免疫系统崩溃，抗体产量不够或者抗体亲和力不佳[4,5]，使用Western Blot 法检测病人的样本，会得出“HIV 抗体不确定”的结果，且随访观察病人血清也不再阳转，这会贻误病人的抗病毒治疗；另外，对于孕产妇，常有干扰抗体导致Western Blot法检测不确定的情况，这种情况下，做不做母婴阻断成了难题。本项目研究Pooling PCR 法的比较优势，以及在医疗卫生机构的临床应用中在特定条件下常规替代Western Blot 法的可行性，现将研究情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 对象与材料在南昌市辖区内选定某省级综合性医疗机构，自2015年1 月至2018年12 月，在病人HIV 抗体筛查有反应时，立即采集血浆样本（全血样本经EDTA 抗凝剂处理）送检。

1.2 仪器与试剂 罗氏公司的cobas AmpliPrep/TaqMan 全自动核酸检测系统,及配套的试剂cobas AmpliPrep/COBAS TaqMan HIV-1 Test,v2.0；MP公司的蛋白免疫印迹仪，及配套的HIV BLOT 2.0试剂。

1.3 方法 该医疗机构将复检有反应的、能采集到血浆的样本（剔除已报告病例和未采集到血浆的病例）按检测流程全部送达江西省疾病预防控制中心进行免疫印迹法(Western Blot，过夜孵育）检测艾滋病病毒抗体，同时检测病毒载量，并观察低载量样本稀释后的核酸检测情况。

2 结果

2.1 送检样本的免疫印迹检测及载量检测总体情况 2015年1 月-2018年12 月，剔除已报告病例和未采集到血浆的病例后，该医疗机构有165 份样本经抗体法（免疫印迹）确证阳性。这165 个病例的病毒载量检测值中，最低值为3330copies/ml，最高值为15800000 copies/ml,中位数为151000 copies/ml，几何均数为159969 copies/ml，见表1。

表1 165例HIV 感染者抗病毒治疗前的样本的病毒载量值分布情况

2.2 载量值较低的样本稀释后的检测情况 从165例样本中选取6 份载量值较低的样本经50 倍、100 倍稀释后做病毒载量检测，均能检测出核酸阳性，见表2。

表2 低病毒载量值样本经稀释处理后的核酸检测情况

2.3 Pooling PCR 法与Western Blot 法的检测效能比较 HIV 抗体阳性的样本，其核酸检测结果全部阳性；在高危人群中，能观察到抗体阴性但核酸阳性即感染早期病例的存在[6]；在艾滋病晚期病例中,常有HIV 抗体不确定但高病毒载量病例的情况。见表3。

2.4 Pooling PCR 法的特异性问题 Pooling PCR 法本质上就是一个检测核酸的方法，只是涉及的样本的集合（混合）和分拆；先检测混合样本，混合样本中发现阳性样本后再逐级分拆定位，最终识别出感染HIV 病毒的病例。在《全国艾滋病检测技术规范（2015 版》中，已介绍了Pooling PCR 法在血液筛查及高危人群中的应用；在《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断（WS 293-2019)》的6.1.1 章节的“d”子项中已列明“有流行病学史或艾滋病相关临床表现，两次HIV 核酸检测均为阳性”即可做出HIV 感染诊断。以上可见，Pooling PCR 法的特异性方面已不是问题。

2.5 Pooling PCR 法与Western Blot 法的检测成本比较 如果某地区艾滋病病毒感染率为万分之十，某医疗机构检测10000 份血样,以识别出其中全部HIV 感染者为最终目的，使用Western Blot 法的理论最大试剂总成本为56800 元，投下去5680 元可以识别出一个HIV 感染者；如使用Pooling PCR 法配套国产试剂检测,用100 份样本组成一个集合样本，集合样本中检出核酸阳性后再逐级拆分，最终识别出HIV 核酸阳性的病人血样，其最大核酸试剂总成本为51000 元，投下去5100 元可以识别出一个感染者[8],见表4。

3 讨论

本研究165 个已感染HIV 但尚未开始抗病毒治疗的病例中，载量最低值为3330copies/ml，最高值为15800000copies/ml。低于5000copies/ml 者有4例，占比为2.42%，按照现行HIV 感染者核酸法5000copies/ml 诊断标准[7]，这部分低病毒载量病例有漏诊的风险。其实现今的核酸检测多为闭盖式的，实验室PCR 扩增产物污染的风险已经得到控制，是否可以下调HIV 感染核酸诊断的载量阈值，后续可以做扩大样本的研究。6例低病毒载量样本经100 倍稀释后仍然能够被检出，所以，一级集合大小设定为100 份样本技术上是可行的。本研究表明，在一级集合大小为100 份样本且人群HIV流行率不高于10‰0的情况下，以发现1 个HIV 感染者所需耗费的平均试剂成本计算，Pooling PCR法的成本略低于Western Blot 法。相对于酶联法、化学发光法、免疫印迹法等检测抗体的方法而言，检测核酸的方法是更敏感的，它的窗口期仅为1周[7]，能发现早期HIV 感染者。自2015年开始，Pooling PCR 法已在献血员的筛查中得到了全国性广泛应用[9,10],发现了不少抗体窗口期病例，为降低输血的残余风险做出了很大贡献。Pooling PCR 法的优势也在于：它能发现和确诊晚期HIV 感染者，有利于艾滋病人尽早获得治疗。这种方法尤其适用于孕产妇样本的检测。对于孕产妇群体，常有干扰抗体导致免疫印迹试验结果为不确定的情况，这增加了孕产妇的心理负担。如果对所有HIV 抗体不确定的孕妇立即进行母婴阻断,可能会导致很多的孕妇接受不必要的抗HIV 病毒治疗，对孕妇、胎儿产生一些不必要的毒副作用。本研究表明，使用Pooling PCR 法以100 份样本做一个一级混合样，其临床应用时的诊断敏感性并不会低于检测抗体的方法。另外，在当地人群的感染率为10‰0以下时，以发现HIV 感染者数计算的人均试剂成本略低于Western Blot 法的成本。所以,使用Pooling PCR 法替代Western Blot 法，用于艾滋病病毒感染的诊断，在经济上是可行的，在实际工作中是必要的。综上可见，在人群的HIV 感染率为10‰0以下时，在规模较大的医疗卫生单位、独立医学实验室、专业体检公司，Pooling PCR 法可以替代Western Blot 法，其特别有利于艾滋病病毒感染早期、晚期病例的诊断以及排除抗体不确定孕产妇的HIV 感染。