外周血PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1与儿童社区获得性肺炎病原体革兰染色类别及耐药水平的相关性

孙宏跃，吴建华，陶占领

（1.郑州市妇幼保健院检验科，河南 郑州 450000；2.郑州市第一人民医院儿科一病区，河南 郑州 450000；3.郑州安图生物工程股份有限公司，河南 郑州 450000）

儿童社区获得性肺炎（CAP）是全球范围内造成5 岁以下儿童死亡的主要原因之一[1]。CAP的及时诊断和疾病严重程度的评估，以及对病原菌的及时鉴别，对于选择合适的治疗方案以及获得良好的预后结局，尤为关键。大量流行病学研究数据显示目前儿童CAP 主要病原微生物为细菌，约占50%以上，分为革兰氏阴性（包括大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌等）和革兰氏阳性细菌（包括金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等）[2]。目前依赖细菌培养及药敏试验明确病原菌和耐药情况，但这往往需要较长时间，不利于儿童患者的治疗。有研究证实革兰氏阳性和阴性细菌患者体内某些炎症因子如降钙素原（PCT）等的表达存在显著差异[3]。但在儿童CAP 中是否存在类似现象，以及新型炎症标志物CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等是否同样存在差异，这些指标对于不同耐药程度的患者是否具有区分能力，目前未见相关报道。据此，本研究将探讨病原菌种类及耐药水平与炎症标志物PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选取2017年3 月-2019年4月间于郑州市妇幼保健院儿科就诊的125例CAP患儿，所有患者年龄均低于5 岁。CAP 诊断符合中华医学会制定的“儿童CAP 管理指南（2013年修订）”[4]。其中男71例，女54例，平均3.58±1.21 岁。所有纳入患儿均排除哮喘、过敏性肺炎和过敏性支气管炎等肺部疾病；排除其他系统感染性疾病患者；利用酶联免疫吸附试验检测MP-IgM和CPIgM 以及荧光定量PCR 法测定核酸以排除支原体和衣原体感染患者；排除入院前使用过抗生素或近期使用过免疫球蛋白的患儿；排除合并自身免疫性疾病的患儿。同时选取30例健康体检儿童，其中男19例，女11例，平均3.61±1.13 岁。研究上报医院伦理委员会批准，所有患儿家属均签订知情同意书。

1.2 痰液标本采集及处理 采集所有患儿治疗前清晨时痰标本2 份至于无菌痰培养管中，立即送至检验科微生物室行痰涂片和药敏培养实验。痰涂片应挑取脓性部分作革兰氏染色，利用镜检筛选合格标本，即：鳞状上皮细胞<10 个/低倍视野，多核WBC>25 个/低倍视野，或鳞状上皮细胞：多核WBC<1:2.5。采用全自动微生物分析仪（美国BD 公司）鉴定细菌和药敏实验。按照美国临床实验室标准委员会制定的药敏判定原则对药敏结果判读，多重耐药为单一病原菌对3 种或3 种以上抗生素同时产生耐药。据此将病原菌分为多重耐药组和非多重耐药组。

1.3 血液标本采集及处理 抽取患儿治疗前清晨空腹静脉血8ml。其中2ml 至于EDTA 抗凝管中用于CD64 指数检测，具体方法如下：取50μl 全血于流式管底部,加入抗人CD64和CD45 抗体各10μl,充分混匀，避光孵育15min，加入500μl 溶血剂，避光10min，1200rmp 5min 离心去上清,加入鞘液1ml后1200rmp 5min 离心去上清,加入500μl 鞘液后上贝克曼FC500 流式细胞仪检测。圈取中性粒细胞和淋巴细胞，分析CD64表达强度。另3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分离血清后用于检测血清PCT 检测，采用罗氏501 电化学发光仪及配套试剂检测。余下3ml 于干燥管，4000rpm 10min 分离血清，-80℃保存，用于酶联免疫吸附实验测定血清Pro-ADM及sTREM-1的浓度，试剂盒均购自购自南京森贝伽生物科技有限公司，酶标仪为科华360，所有步骤严格按照实际说明书执行。

1.4 统计学分析 利用Graphad prism 6.0 统计软件处理实验数据，所有数据以（）表示。两样本均数比较采用独立样本t 检验，多组间均数比较采用单因素方差分析；两组间相关性利用Spearman 相关分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 125例CAP患儿痰培养和药敏结果 125例CAP患儿经过痰培养，75例培养出单一病原菌并行药敏实验，细菌检出率为60.00%；其余50例为未培养出任何细菌，疑为病毒或支原体感染。感染患儿的检出细菌中,革兰氏阴性菌有43例（57.33%），革兰氏阳性菌有32例（42.67%）。21 株大肠埃希菌（28.00%）、12 株鲍曼不动杆菌（16.00%）以及10 株肺炎克雷伯菌（13.33%）构成了革兰阴性菌谱；17 株金黄色葡萄球菌（22.67%）和15 株肺炎链球菌（20.00%）构成了革兰氏阳性菌谱。革兰氏阴性菌主要对氨苄西林、头孢曲松和头孢他啶耐药；革兰式阳性菌主要对青霉素、红霉素以及克林霉素等耐药率较高。75 株菌共检出31 株多重耐药菌，占41.33%，纳入多重耐药菌组；其余44 株菌自动入组至非多重耐药菌组。

2.2 CAP患儿和健康对照组 间PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差异分析 CAP患儿治疗前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1水平均显著高于健康对照人群，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 CAP患儿和健康对照组间PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比较

2.3 感染革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌CAP患儿PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差异分析 依据感染的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌将CAP患儿分为两组，比较结果发现革兰氏阳性菌组PCT、Pro-ADM和sTREM-1 均显著低于革兰氏阴性菌组,差异具有统计学意义（P<0.05）。而CD64 指数虽在数值上低于革兰氏阴性组,无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌间PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比较

2.4 多重耐药组和非多重耐药组患儿PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的差异分析 依据药敏结果将感染菌分为多重耐药和非多重耐药,结果发现多重耐药组PCT和CD64 均显著高于非多重耐药组，差异有统计学意义（P<0.05）,但Pro-ADM和sTRE M-1在两组间并无显著差异（P>0.05）。见表3。

表3 多重耐药组和非多重耐药组间PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1的比较

3 讨论

儿童CAP 已经成为5 岁以下儿童的主要死亡原因，在该人群中较为常见，目前已经位居全球儿童常见疾病谱前列[5]。流行病学调查显示在西方国家5 岁以下儿童CAP 发病率约为3.4%左右，而在中国每年约有35 万左右5 岁以下儿童因CAP 死亡[6]。鉴于其极大的危害性，如何提高患儿病原学的及早诊断以获得高效的治疗方案，已经成为该领域的重点研究方向。依据病原微生物类别，儿童CAP 主要有细菌、病毒以及支原体和衣原体等[7]。其中细菌感染占据主要地位，如本研究发现125例中经过痰培养分离鉴定出75例细菌感染，占比高达60%。这与师红玲[8]和夏厚才[9]等众多不同地区的调查结果一致，表明我国儿童CAP患儿病原体中依然以细菌性感染为主。此外，细菌谱中革兰阴性菌检出率显著高于革兰阳性菌，主要为大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌[10,11]。革兰阴性和阳性菌检出率与国内大部分研究报道一致，但主要的菌谱却有所不同，如闽南地区以肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌为主，这可能是因为地域差异以及季节流行差异造成的[12,13]。分析耐药结果显示，多重耐药菌检出率高达41.33%，这与河南地区的另一研究结果一致，提示同一地域儿童CAP多重耐药率相似[8]。

血清学研究发现CAP患儿治疗前血清PCT、CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等的水平均高于健康儿童，提示除了经典的PCT 指标外，CD64、Pro-ADM及sTREM-1 等或可成为儿童CAP的新型感染评价指标。这与吴佳辉等[13]发现的CD64和sTR EM-1在细菌组和支原体组CAP患儿中异常增高，以及王彦锋等[14]在婴幼儿细菌性肺炎患者中发现的PCT和Pro-ADM 显著上调等结果相一致。但这些研究都没有进一步分析这些指标是否在不同革兰染色以及不同耐药程度细菌间的差异。而本研究的分析结果显示革兰氏阴性菌组具有较高水平的PCT、Pro-ADM和sTREM-1，而CD64 指数则并无差异。郝玉清等[15]在血流感染的成年患者中也发现革兰阴性细菌感染的患者具有较高水平的PCT和sTREM-1。此外CD64 指数在革兰阴性和阳性菌间的差异研究并不一致，存在差异或并无差异，有待于进一步研究。但目前并没有研究评估Pro-ADM对于革兰氏阴性菌和阳性菌的区分能力,而本研究也初步证实Pro-ADM的这种潜力。另，多重耐药组具有较高的PCT和CD64水平，这与罗迪等[16]评价的PCT与耐药性的研究以及一致,但关于CD64与耐药性的关系研究先前亦未见报道。以上结果同时也表明这些炎症指标虽都可以提示儿童CAP细菌感染，但在预测不同革兰染色以及耐药情况则功能有所不同。而这一结果将有助于临床在细菌培养前提前判断革兰阴阳性以及耐药程度，以便提前合理且针对性的使用抗生素，改善患者预后。

总之，本研究初步证实高水平PCT、Pro-ADM和sTREM-1与儿童CAP 革兰氏阴性菌感染相关；而多重耐药菌感染患者则具有较高水平的PCT和CD64 这些炎症指标均与与儿童CAP细菌感染密切相关,可作为预测疾病发生发展的生物标志物，但同时应当在第一时间行痰培养,明确病原菌,精准选用抗菌药物,提高早期治疗效果，改善患儿预后。