miRNA-223-3p在冠心病合并心肌纤维化中的变化及临床意义

王东华

（鹤壁煤业（集团）有限公司总医院心内科，河南 鹤壁 458000）

冠心病是一种发病率和死亡率均较高的疾病，严重威胁人类健康，目前公认动脉粥样硬化的病理过程是导致冠心病发生、演化以及进一步恶化的主要原因[1]。冠心病疾病进展过程中，心脏成纤维细胞被激活合成过多的Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白，细胞外基质（ECM）过度沉积于心肌组织中，心肌纤维化的发生导致心肌僵硬、心律失常、心功能降低，是心脏重构的重要病理学基础，其最终结局是心功能衰竭[2,3]。抑制ECM 过度沉积是预防心肌纤维化的重要措施,临床也需要寻找新的生物标志物为心肌纤维化提供准确、敏感的预警,为冠心病的治疗和预后判断提供依据[4]。微小核糖核酸（mi RNA）是一类序列高度保守的内源性单链非编码小分子RNA，既往研究发现miRNA 参与冠心病发生、发展病理过程的调节，对心肌纤维化有一定的调控作用[5]。本研究选择对冠心病患者的血清miR NA-223-3p 进行检测，旨在探讨其与心肌纤维化的关联，报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2017年1 月-2019年12 月我院收治的冠心病患者102例，其中男61例，女41例，年龄42～76 岁，平均57.45±11.39 岁。诊断标准：经冠脉造影证实存在1 支或1 支以上的冠状动脉血管直径狭窄≧50%。排除标准：合并先天性心脏病、心脏瓣膜病、心律失常或慢性阻塞性肺疾病者；合并严重肝肾功能不全者；合并急慢性感染性疾病者；合并血液系统疾病、周围血管性疾病者；合并恶性肿瘤或全身免疫系统疾病者。根据心脏磁共振成像的诊断结果进行分组，冠心病合并心肌纤维化者53例为观察组，未合并心肌纤维化者49例为对照组。本研究经医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基线资料收集 记录性别、年龄、体重指数、饮酒史、吸烟史、糖尿病史、高血压病史、冠心病家族史等情况。入院次日清晨采集患者空腹外周静脉血6ml，离心并分离血清，分三份备用。一份用于各项生化指标的检测，一份用于血清miRNA-223-3p 检测，另外一份用于纤维化指标检测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测C 反应蛋白（CRP）水平，试剂盒由上海康朗生物科技有限公司提供；采用迈瑞BS-180 全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平；采用血糖仪检查空腹血糖水平。

1.2.2 血清miRNA-223-3p 检测 血清RNA 快速提取试剂盒购买自杭州昊鑫生物科技股份有限公司，提取步骤如下：⑴向250μl 血清中加入750μl Lysis buffer 裂解试剂,室温孵育15min；⑵加入200μl 氯仿，剧烈振荡15s，室温孵育2min；⑶4°C 12000rpm 条件下离心10min，可见样品分三层，RNA 存在于上层无色水相；⑷小心吸取上清液，转移至新的EP 管中，加入1.5 倍体积的常温状态下的无水乙醇，混匀，转移至带吸附柱的2ml 离心管中，4°C 12000rpm 条件下离心30s，弃液；⑸加入700μl Wash Solution 1，离心，弃液，再加入500μl Wash Solution 2，离心，弃液，重复一遍；⑹将吸附柱放回空离心管中，4°C 12000rpm 条件下离心2min，将吸附柱放到一个新的无RNase 离心管中，加入预热的无RNase水40μl，室温静置1min，4°C 12000rpm 条件下离心1min，得到总RNA。使用一步法miRNA 反转录试剂盒（新海基因）进行反转录，合成cDNA。实时荧光定量PCR：根据SYBR Premix Ex Taq TM II（Taka Ra，日本）制备20μl RT-qPCR 反应体系，并使用ABI7500 荧光定量PCR 仪器（Applied Biosystems，USA）进行扩增。计算目的基因miRNA-223-3p的表达水平。

1.2.3 血清纤维化指标检测 采用双抗体酶联免疫吸附法测定Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）水平，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 软件对数据进行处理和分析。计数数据以（%）表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量数据以（）表示，两组间比较采取独立样本t 检验；用受试者工作曲线（ROC）和曲线下面积（AUC）评估血清miRNA-223-3p对心肌纤维化的诊断价值；危险因素分析采取多因素Logistic 回归模型；相关性分析采取Pearson 相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组冠心病患者基线资料比较 两组患者性别、年龄、体重指数、饮酒史、吸烟史、糖尿病史、高血压病史、冠心病家族史、TG、TC、HDL-C、LDL-C、空腹血糖比较，差异无统计学意义（P>0.05），观察组患者CRP水平高于对照组（P<0.05）。见表1。

表1 两组冠心病患者基线资料比较[n（%），]

表1 两组冠心病患者基线资料比较[n（%），]

2.2 冠心病患者血清miRNA-223-3p对心肌纤维化的诊断价值 观察组、对照组患者血清miRNA-223-3p表达水平分别为6.04±1.10、3.69±0.81，观察组水平明显高于对照组（t=12.376，P<0.05）。ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-223-3p 诊断心肌纤维化的AUC 值为0.961（95%CI：0.903～0.989，P<0.05），临界值取4.61 时诊断价值最高，敏感度为92.45%，特异度为87.76%，约登指数为0.8021。见图1。

图1 血清miRNA-223-3p 诊断心肌纤维化的ROC 曲线

2.3 冠心病患者发生心肌纤维化的危险因素分析以冠心病患者是否发生心肌纤维化为因变量（赋值：心肌纤维化=1，无心肌纤维化=0），将血清CRP、miRNA-223-3p 作为自变量进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，CRP﹥7.53mg/L、miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者发生心肌纤维化的独立危险因素（P<0.05）。见表2。

表2 冠心病患者发生心肌纤维化的危险因素分析

2.4 两组患者血清纤维化指标比较 观察组患者血清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-9水平高于对照组（P<0.05）。见表3。

表3 两组患者血清纤维化指标比较（）

表3 两组患者血清纤维化指标比较（）

2.5 相关性分析 Pearson 相关分析结果显示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平与血清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-9水平均呈现显著的正相关（r=0.567、0.492、0.687，P<0.05）。

3 讨论

心肌纤维化过程是心脏重构的重要病理学基础，而心脏重构是导致心力衰竭发生的基本机制，因此心肌纤维化的早期诊断和有效防治尤为重要[6]。除心脏影像学检查外，血清生物标志物检测是临床上判断心肌纤维化的有效手段。

miRNA与心血管疾病的关系密切，在心肌梗死、动脉粥样硬化、心律失常等疾病的病理机制和发展演变过程中扮演了重要角色[7]。近年来研究发现，多种miRNA通过不同信号通路参与了心肌纤维化的调控[8]。miRNA-223 位于X 染色体的q12基因组内，在生物进化过程中具有高度的保守性，在调控细胞增值分化、抑制炎症反应过程中扮演着重要角色[9]。miRNA-223 是冠心病的保护因素，通过多种靶基因保护机体维持正常的生理过程，在疾病进展过程中出现代偿性增高[10]。本研究选择对102例冠心病患者的血清miRNA-223-3p水平进行检测，结果显示，合并心肌纤维化者血清miRNA-223-3p水平明显高于无心肌纤维化者。经ROC 曲线分析发现血清miRNA-223-3p 诊断心肌纤维化的AUC 值为0.961，临界值取4.61 时诊断价值最高，敏感度为92.45%，特异度为87.76%，提示miRNA-223-3p 可作为心肌纤维化的血清学生物标志物。进一步进行多因素Logistic 回归分析，结果显示，miRNA-223-3p﹥4.61 是冠心病患者发生心肌纤维化的独立危险因素。上述结果表明，miRNA-223-3p与心肌纤维化存在显著的相关性，临床上可通过该项指标的检测判断冠心病是否发生心肌纤维化。

本研究还对冠心病患者的血清CRP水平进行检测，评估其炎症水平，发现合并心肌纤维化患者炎症水平明显高于无心肌纤维化者，且CRP﹥7.53mg/L 是冠心病患者发生心肌纤维化的独立危险因素。上述结果提示冠心病患者的炎症反应也会影响到心肌纤维化的发生，而miRNA-223-3p对炎症反应有抑制作用，因此冠心病患者炎症水平越高其在血清中代偿性增高，发生心肌纤维化的可能性越大。部分研究发现[11,12]，miRNA-223与冠心病的危险因素（血脂异常、吸烟、糖尿病）存在一定的关联性，但本研究结果显示，两组患者在吸烟史、糖尿病史、血脂水平等方面比较，差异不显著，分析原因可能与病例选择偏倚有关，今后可扩大病例入选范围和样本量进一步展开研究。

Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原是较为常见的血清纤维化指标，Ⅰ型胶原增生可导致心肌僵硬度增加，Ⅲ型胶原伸展回弹性较大，过度增生导致胶原纤维强度降低，心肌组织往往不能承受较大的血液动力学压力，因此易发生梗死区的变薄和延伸，需早期干预Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的过度增生[13,14]。MMP-9 作为一种锌依赖的金属蛋白内切酶家族中的一员，参与降解多种ECM 成分，调节MMP-9的表达可对抗心肌纤维化的发生[15]。因此本研究选择上述血清纤维化指标进行检测，发现合并心肌纤维化者血清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-9水平明显更高，而Pearson 相关分析结果显示，102例冠心病患者血清miRNA-223-3p水平与各项血清纤维化指标均呈现显著的正相关。此结果再次验证了miRNA-223-3p与心肌纤维化的相关性，冠心病患者心肌纤维化程度越严重则其在血清中表达越高，可作为反映心肌纤维化程度的指标在临床应用。

综上所述，冠心病患者血清miRNA-223-3p水平对心肌纤维化有较高的诊断价值，可反映心肌纤维化程度，该指标联合血清Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MMP-9水平变化可作为心肌纤维化的生物标志物用于评估病情严重程度，但miRNA-223-3p参与调控心肌纤维化的机制尚需进一步的研究。