宫颈癌PIK3R1基因表达水平及临床意义

魏轩辉

（郑州大学附属洛阳中心医院检验科，河南 洛阳 471000）

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，在女性癌因性死亡中，宫颈癌居第二位[1,2]。目前针对宫颈癌仍缺乏特异性的诊断和预后预测的分子标志物，尽管鳞状上皮细胞抗原（Cervical Squamous Cell Carcinoma，SCCA）在宫颈癌的诊断及预后评估中具有重要作用，但近年来发现其诊断特异性较低，部分皮肤疾病、食道疾病、乳腺疾病患者也会出现SCCA 升高造成假阳性诊断的情形[3,4]。因此寻找与宫颈癌诊断及预后相关的生物标志物成为亟待解决的问题。已有文献[5]报道磷脂酰肌醇-3 激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）基因与乳腺癌的发生、发展密切相关，可能参与调节乳腺肿瘤的侵袭和转移。目前关于PIK3R1在宫颈癌中表达情况及其与宫颈癌发生、发展的关系尚不完全清楚。本研究通过检测PIK3R1在宫颈癌患者的表达情况，旨在为宫颈癌的诊断及预后评估寻找分子标志物。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年6 月-2017年6 月本院收治的60例行手术治疗的宫颈癌患者的病理组织标本（CC 组），年龄29～78（51.84±9.42）岁。纳入标准：⑴符合国际妇产科联合会（FIGO）宫颈癌分类标准[6]，并经病理确诊为宫颈癌；⑵术前无放疗和化疗史者。排除标准：⑴合并其他系统原发性肿瘤的患者；⑵合并严重心、肝、肾功能障碍者；⑶随访资料不完整者。另收集同期与宫颈癌患者年龄匹配的42例因良性疾病切除的新鲜宫颈组织为对照组。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料采集 查阅病历记录采集宫颈癌患者年龄、病理类型、FIGO 分期、淋巴结转移以及病理分级等临床资料；所有患者术后随访观察3年，术后随访以电话及门诊方式进行,记录患者随访期内生存情况，总生存率（overall survival，OS）计算终点为各种因素导致的死亡。

1.2.2 组织标本中PIK3R1基因检测 采用qRTPCR 法检测，参照Trizol 试剂（日本TaKaRa 公司）说明书从组织样本中提取总RNA，提取的总RNA以逆转录试剂盒（瑞士罗氏）合成cDNA，反应条件：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存，进行逆转录反应。参照Pubmed 数据库中目的基因mRNA 序列委托上海生工进行PIK3R1及GAPDH引物设计合成。使用GAPDH 作为实验内参，采用全自动荧光定量PCR 分析仪（罗氏cobas z480）进行实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测PIK3R1 相对表达水平。采用2-ΔΔCt法计算PIK3R1基因的相对表达水平。

1.2.3 PIK3R1 编码蛋白（p85α蛋白）检测 采用免疫组化检测，石蜡包埋的组织标本4μm 连续切片，使用二甲苯连续脱蜡3 次，梯度乙醇脱二甲苯，水洗。3%过氧化氢室温孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性；然后以10mmol/L 柠檬酸钠/胃酶修复液进行热抗原修复。冷却后滴加兔抗人p85α多克隆抗体（上海生工）,4℃孵育过夜,复温0.5～1h 后，PBS冲洗3 次，滴加二抗工作液，37 孵育20min 后，PBS冲洗3 次，采用DAB 显色，严格控制显色时间，常规脱水、封片。使用已知阳性切片作为阳性对照，PBS 替代p85α 一抗作为阴性对照。分别在4 个随机高倍视野(×400)下对阳性细胞进行计数并取其平均值。显微镜下随机选取5 个切片视野（×200），采用Image J 软件分析显微镜下细胞分布情况。判定标准：p85α 分布于细胞浆或细胞核，以胞浆或胞核出现巧克力样染色为阳性细胞。以细胞核染色强度结合阳性细胞百分比对p85α表达情况进行判读，计算阳性细胞百分比并赋予分值，0%计为0分，～10%为1 分，～30%为2 分，～50%计3 分，50%及以上计4 分；观察染色强度并赋予分值，无色计0 分，浅棕色计1 分，棕黄色计2 分，巧克力色计3分。以上两项分值乘积＜3 分为阴性（-），≥3 分为阳性（+）。

1.3 统计学处理 使用SPSS 20.0 进行数据统计分析，计量资料以（）表示，使用t 检验比较；计数资料采用率表示，采取χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier 法，并使用Log-rank 法进行显著性检验。所有检验均采取双侧检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组PIK3R1表达比较 CC 组PIK3R1基因表达水平显著低于对照组；p85α蛋白主要定位于细胞质中，CC 组p85α 阳性表达率显著低于对照组（P<0.05），见表1和图1。

图1 免疫组化检测PIK3R1基因编码蛋白（p85α）表达

表1 两组PIK3R1基因及其编码蛋白p85α表达比较

2.2 宫颈癌癌组织中p85α蛋白表达与临床病理特征的关系 p85α蛋白阳性表达率与年龄、病理类型和病理分级无关（P>0.05）,与FIGO 分期、淋巴结转移相关（P<0.05），Ⅲ、Ⅳ期患者p85α蛋白阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者（P<0.05），有淋巴结转移者p85α蛋白阳性表达率明显低于无淋巴结转移者（P<0.05）。见表2。

表2 宫颈癌癌组织中p85α蛋白表达与患者临床病理特征的关系

2.3 宫颈癌癌组织p85α蛋白表达与宫颈癌患者预后的关系 本研究观察期内，60例宫颈癌患者共有27例（45.0%）死亡，p85α蛋白阳性组实际生存率（77.78%，14/18）明显高于p85α蛋白阴性组（45.24%，19/42）（P<0.05）。进一步使用Kaplan-Meier 生存曲线分析宫颈癌患者生存资料，p85α蛋白阳性组整体生存情况优于p85α蛋白阴性组（P<0.05），见图2。

图2 p85α 阳性、阴性宫颈癌患者的Kaplan-Meier 生存曲线

3 讨论

P13K/mTOR/AKT通路异常激活与肿瘤疾病的发生、发展密切相关，其通过影响细胞间信号传导来调控细胞生长、增殖、迁移及代谢等生物过程[7]。研究指出[8]，宫颈癌存在P13/mTOR/AKT通路异常激活现象。磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol -3-kinase，PI3K）作为是磷脂激酶家族成员，是多个亚基组成的多聚体，主要发挥催化底物的作用，可将细胞外信号传递至细胞内来产生一系列胞内反应，并由Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类亚基执行不同功能[9]。研究已证实抗肿瘤药物可抑制P13K 信号通路活性来诱导宫颈癌细胞凋亡，P13K的靶向抑制剂也正在逐渐走向临床试验阶段[10]。PIK3R1则是PI3K的调节亚基之一，多个研究[11,12]证实在恶性肿瘤疾病中存在PIK3R1 突变及异常表达。本研究也显示，CC 组PIK3R1基因表达水平显著低于对照组；这与往期报道结论相符[13]，均证实PIK3R1基因表达与恶性肿瘤疾病存在显著关联。

PIK3R1基因突变位于其编码蛋白p85α蛋白的iSH2 区，p85α蛋白可发挥稳定p110 亚基、抑制p110 酶活性、招募磷酸化的络氨酸残基等作用[14]。研究指出，PIK3R1基因突变虽仍可保持结合、稳定p110 催化亚基的能力，但其抑制p110 活性的能力下降，从而促进P13K 活性增强，促进细胞恶性转化[15]。Chen 等[16]指出p85α蛋白在乳腺癌的表达缺失促使PI3K 信号增加，进而促进机体组织癌变[16]，但其在CC 中的临床研究仍有待补充。本研究显示，p85α蛋白主要定位于细胞质中，CC 组p85α 阳性表达率显著低于对照组，提示PIK3R1 编码蛋白p85α与CC 存在关联。

进一步比较不同临床特征的CC患者p85α蛋白表达情况，结果显示FIGO 分期Ⅲ、Ⅳ期患者p85α蛋白阳性表达率明显低于Ⅰ、Ⅱ期患者，有淋巴结转移者p85α蛋白阳性表达率明显低于无淋巴结转移者。由此可见，宫颈癌癌组织中p85α表达缺失可能与宫颈癌的侵袭、转移相关。往期研究报道，p85α 可与p110 类催化亚基形成异源二聚体，当无外源信号刺激时，p85与p110 结合来抑制p110 酶活性，在受体络氨酸激酶（RTK）或G蛋白偶联受体（GPCR）活化后，Ⅰ类P13K 亚基可被招募至细胞膜附近，此时p85对p110的抑制作用解除，p110 催化PIP2 转化为PIP3，PIP3 再作为第二信使将信号继续向下游信号通路传导，从而影响肿瘤疾病侵袭、转移。本研究分析了所有入选宫颈癌患者的随访生存资料，发现p85α 阳性表达组整体生存情况优于阴性表达组，预后相对更好，进一步证实PIK3R1表达缺失宫颈癌患者预后有密切关系，提示PIK3R1及其编码蛋白p85α 可能是一种新的宫颈癌生物标志物和治疗靶点，其具体的分子作用机制仍有待进一步研究。

综上所述，PIK3R1在宫颈癌异常表达，宫颈癌癌组织中PIK3R1表达缺失可能预示着宫颈癌癌分期晚、存在淋巴结转移以及预后不良。