菠萝蜜AhSS2基因克隆及生物信息学预测

薛亚茹 李莹 李映志

摘要蔗糖合成酶（ sucrose synthase，  SS）作为催化蔗糖代谢的关键酶之一，能够参与蔗糖的代谢和运输，调节细胞分化与细胞壁的形成，对调控作物的品质和产量也有重要作用。克隆出菠萝蜜 AhSS2基因并对其进行生物信息学分析。菠萝蜜 AhSS2基因的开放阅读框（ open reading frame，  ORF）全长2436 bp，共编码811个氨基酸，其蛋白理化性质预测显示，相对分子量是92.583 ku，等电点pI为5.77，属亲水性酸性蛋白质，二级结构主要为 Alpha helix （α-螺旋）。保守结构域分析显示，菠萝蜜 AhSS2基因属于 PLN00142超级家族成员，主要包括蔗糖合成酶结构域（ Sucrose_synth）与糖基转移酶结构域（Glycos_transf_1）2个保守结构域。磷酸化位点预测显示，菠萝蜜 AhSS2基因蛋白的磷酸化位点主要是丝氨酸（ Ser）磷酸化位点。系统发育树分析显示，菠萝蜜 AhSS2基因在分类上属 SSⅡ。本研究为进一步研究菠萝蜜蔗糖合成酶家族成员的功能提供依据。关键词菠萝蜜;蔗糖合成酶;生物信息学;系统进化分析

中图分类号 S667.8 文献标识码 A  DOI：10.12008/j.issn.1009-2196.2021.12.015

Bioinformatics Prediction and Comparative Analysis of Jackfruit AhSS2 Gene

XUE Yaru  LI Ying  LI Yingzhi

（Coastal Agricultural College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang， Guangdong 524000， China）

Abstract  Sucrose  synthase （SS） is  one  of  the  key  enzymes  catalyzing  sucrose  metabolism. It  can participate in sucrose metabolism and transportation， regulate cell differentiation and cell wall formation， and also play an important role in regulating crop quality and yield. Jackfruit AhSS2 gene was cloned and bioinformatic analysis was performed. The open reading frame （ORF） of jackfruit AhSS2 gene is full-length 2436 bp， encoding a total of 811 amino acids. The predicted relative molecular weight of the protein is 92.583ku， and the isoelectric point （Pi） is 5.77. It is a hydrophilic acidic protein and its secondary structure is mainly  alpha helix （α-Spiral）. The  conserved  domain  analysis  showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to a PLN00142 superfamily member， including two conserved domains： sucrose synthase domain （Sucrose_synth） and  glycosyltransferase  domain （glycos_ transf_1）. Prediction  of phosphorylation  sites showed that the phosphorylation sites of the jackfruit AhSS2 gene are mainly serine （Ser） phosphorylation sites. Phylogenetic tree analysis showed that the jackfruit AhSS2 gene belonged to SSII in classification. This  study  provides  a  basis  for  further  research  on  the  function  of jackfruit  sucrose  synthase  family members.

Keywords  jackfruit ; sucrose synthase ; bioinformatics analysis ; phylogenetic analysis

菠蘿蜜 （ Artocarpus heterophyllus Lam.）为桑科 （ Moraceae）菠萝蜜属（ Artocarpus）植物，是世界著名的热带水果。其果实香气浓郁，果肉味美甘甜，营养丰富，有热带水果皇后之称。

对大部分植物来说，蔗糖是重要的转运糖，是大部分非光合组织有机碳的重要来源，但蔗糖本身不能被直接利用，需被分解成可溶性单糖才能参与植物的各项生理代谢活动。植物体内存在蔗糖转化酶 （ Invertase， INV）和蔗糖合成酶（ SS）2种分解蔗糖的酶， INV是将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，该反应为不可逆反应; SS 则能在几乎不消耗能量的前提下发生将蔗糖分解生成二磷酸尿苷-葡萄糖 （uridine diphosphate glucose， UDPG）与果糖的可逆反应[1]。已有研究表明， SS 基因家族成员在调节蔗糖的分解与合成[2]、调控淀粉生物合成[3]、纤维细胞分化[4]、抗逆性提高[5]等方面发挥着重要的作用。

本研究采用 RACE 技术扩增菠萝蜜中的AhSS2基因全长序列，对该基因的开放阅读框和氨基酸序列进行相关的生物信息学分析，以期为研究 AhSS2基因的功能及其体内表达，进一步揭示菠萝蜜果实品质形成机制以及菠萝蜜的分子育种提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料

菠萝蜜为广东海洋大学农学院种植资源圃内种质 B5-23，在果实成熟期，采摘鲜果，取样后立刻用液氮冷冻保存于-80℃中以备后用。

1.1.2主要仪器设备

3H30R1智能高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）， AUY120岛津电子分析天平（日本岛津公司）， T1+/T1单槽 PCR仪（德国Biometra公司）， UV756CRT 型紫外可见分光光度计（上海佑科仪表有限公司）， DYY-6C 电泳仪（北京六一仪器厂）， DYCP-31E 电泳槽（北京六一仪器厂）， Elix5超纯水仪（美国 Millipore公司）， YXQ-LS-100SII 型高压蒸汽灭菌锅（上海博迅公司），恒温培养箱，超净工作台，恒温摇床等。

1.2方法

1.2.1总 RNA 的提取和 cDNA 第一链的合成

菠蘿蜜果实的总 RNA 提取参照宝生物RNAiso- mate for Plant Tissue提取试剂盒说明书，按照宝生物 Prime ScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，合成 cDNA第一链。

1.2.2菠萝蜜AhSS2基因克隆

利用 RACE （rapid-amplification of cDNAends） 技术克隆了菠萝蜜蔗糖合成酶基因（ AhSS2）的全长序列。根据前期试验已经得到的蔗糖合成酶基因中的保守序列，利用Primer Pre ‐mier 6.0软件设计3RACE和5RACE 基因的特异性引物。3RACE扩增体系总体积为20?L：MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L，10×PCR Buffer 2.0?L， cDNA溶液1.0?L，上游引物3GSP 0.2?L，下游引物 UPM 2.0?L，TaKaRa Taq 0.2?L，灭菌水11.4?L。PCR 反应的条件：94℃5 min; 94℃1 min，72℃3 min，共5个循环;94℃1 min，70℃50 s，72℃3 min，共32个循环;72℃10 min;4℃1 h。5RACE 扩增体系与反应条件同3RACE相同，引物为5GSP。PCR 扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用鼎国生物 DNA快速回收/纯化试剂盒，切胶进行回收;通过 pMD19-T 载体进行 T 载体连接，转化至制备好的感受态细胞，培养单菌落，利用菌落 PCR筛选阳性克隆并送广州生工生物科技有限公司测序。菠萝蜜 AhSS2基因全长扩增体系总体积为20?L： MgCl21.2?L， dNTPs 2.0?L， 10×Taq Buffer with （ NH4）2SO42.0?L，cDNA溶液2.0?L，上游和下游引物共0.8?L，Taq 0.2?L，灭菌水11.8?L。 PCR扩增条件：94℃4 min;94℃1 min，55～58℃50 s， 72℃1 min;共35个循环， 72℃10 min，4℃保存。按之前的步骤对得到的产物进行回收、纯化、克隆，将其与测序结果进行比对，从而得到基因的内含子及外显子序列。

1.2.3菠萝蜜AhSS2基因的生物信息学分析

利用 NCBI 进行 BLAST 比对，利用 ORF finder 软件寻找并预测菠萝蜜 AhSS2基因的全长序列开放阅读框;使用 CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/docs/cdd_ search.html）在线软件对蛋白质保守结构域进行分析预测;利用在线软件ExpasyProtParam （https：//web.ex‐pasy. org/cgi-bin/protparam/protparam） 预测菠萝蜜 AhSS2基因编码蛋白理化性质;利用在线软件 TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/servic ‐ es/TMHMM/）预测菠萝蜜 AhSS2基因编码蛋白的跨膜结构;利用在线软件NetPhos （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/） 预测菠萝蜜 AhSS2基因的磷酸化位点;利用在线软件ExPasy-ProtScale  （https：//web. expasy. org/ protscale/）预测菠萝蜜 AhSS2基因的亲疏水性;利用 SOPAM （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi- bin/secpred_sopma.pl）预测蛋白二级结构并进行分析;使用 SWISS-MODEL 软件预测蛋白三级结构;采用 MEGA X 软件的 Neighbor-Joining 法构建系统进化树。

2结果与分析

2.1菠萝蜜AhSS2基因克隆及序列分析

电泳结果显示，28S 和18S 的条带清晰完整（图1），可用于下一步实验。将逆转录后的 cDNA 第一链作为模板，进行 RACE 扩增，电泳结果见图2-A （3端扩增的目标条带）、图2-B （5端扩增的目标条带）。将目的条带进行胶回收纯化，胶回收产物经连接转化后进行测序，得到目的基因序列，命名为 AhSS2;该基因包含一个长为2436 bp 的开放阅读框（open reading frame， ORF），位于148～2583 nt，共编码811个氨基酸 （图3）。

2.2菠萝蜜AhSS2基因编码蛋白的理化性质分析

蛋白理化性质分析结果显示，编码氨基酸数量为811个，蛋白的相对分子量是92.583 ku，等电点pI为5.77，属酸性蛋白质，酸性氨基酸总数（Asp+Glu）为110，碱性氨基酸总数 （Arg+Lys）为94。该蛋白不稳定系数为36.86，属稳定蛋白。脂肪系数为90.17。亲水性平均值（ GRAVY）为-0.259，属于亲水性蛋白。

2.3菠萝蜜AhSS2基因编码蛋白质的保守结构域

使用 CDD在线软件对蛋白质保守结构域进行分析预测，结果发现了2个明显的结构域（图4）：一个是蔗糖合成酶位点，位于8～555 nt，该家族包括大部分的蔗糖合成酶蛋白，而蔗糖合成酶的羧基末端区域属于糖基转移酶家族 IPR001296，该酶主要存在于植物中，但也出现在细菌中;另一个是糖基化转移酶位点，位于558～745 nt，二糖、寡糖和多糖的生物合成有许多不同糖基转移酶参与，这些酶催化了糖基从活性受体分子到特定受体分子间的转移，形成糖苷键。

2.4菠萝蜜AhSS2基因编码蛋白的跨膜结构区、亲疏水性

TMHMM对菠萝蜜 AhSS2基因跨膜区的预测分析结果表明，该蛋白不存在跨膜结构（图5）。

ProtScale对基因的疏水性分析结果如图6所示。正值越大，该区域疏水性越强;负值越小，表明该区域亲水性越强。菠萝蜜的最大值为2.544，最小值为-3.011，为亲水性蛋白，与ProtParam中的理化性质预测结果类似。

2.5菠萝蜜AhSS2基因编码蛋白的磷酸化位点利用在线软件对上述蛋白氨基酸序列中的磷酸化位点进行预测分析，以 0.5为阈值，结果显示，菠萝蜜中共有113个磷酸化位点（图7），其中丝氨酸磷酸化位点（ serine，Ser）67个，苏氨酸磷酸化位点（threonine，Thr）28个，酪氨酸磷酸化位点（tyrosine，Tyr）18个，由此推测其生物功能是以丝氨酸磷酸化修饰调控为主。

2.6菠萝蜜AhSS2基因的蛋白结构预测

2.6.1蛋白二维结构

利用 SOPA 预测蛋白的二级结构，结果如图8所示。图中蓝色曲线代表α-螺旋，绿色曲线代表β-折叠，红色曲线代表突出链，紫色曲线代表无规则卷曲。分析发现，该基因编码的二级结构主要有占比52.77%的α-螺旋、占比13.07%的延伸链、占比7.77%的β-折叠和占比为26.39%的无规则卷曲等4种构象，据此推测该蛋白的二级结构主要为α-螺旋。

2.6.2蛋白三维结构

用 SWISS-MODEL 对氨基酸序列进行比对分析，根据数据库中已有的蛋白质三级结构进行 AhSS2基因的三级结构预测，结果如图9所示。

2.7系统进化分析

根据进化分析可将高等植物 SS基因分为3种类型，即 SS Ⅰ、SS Ⅱ、SSⅢ， SS Ⅰ又可分为单子叶组 （ Monocot SS Ⅰ） 和双子叶组 （ Dicot SSⅠ）[6-9]。通過与拟南芥、水稻构建系统发育树（图10）发现，菠萝蜜 AhSS2属于 SSⅡ。

通过ClustalX对川桑、枣、核桃、葡萄的 SS2基因与菠萝蜜 AhSS2基因进行多序列比对，并利用 MEGA 5.0构建系统发育树（图11）。结果发现，菠萝蜜 AhSS2基因与核桃、葡萄的 SS2基因同源性以及系统进化关系较近。

3讨论

SS基因能够参与蔗糖的代谢和运输，调节细胞分化与细胞壁的形成，对调控作物的品质和产量也有重要作用。目前已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）[10]、玉米（ Zea mays）[11]、番茄（Ly ‐copersicon esculentum）[12]、水稻（Oryza sati ‐va）[13]等多种植物中进行了 SS基因研究。通过与拟南芥、水稻构建系统发育树发现，菠萝蜜 AhSS2属于 SSⅡ。在同一植物中不同类型的 SS基因的表达具有发育、组织器官和功能特异性。

目前认为，蔗糖合成酶基因含有2个结构域：蔗糖合成酶结构域、糖基转移酶结构域[14]，这与本研究结果相符。根据 SS 与质膜的紧密联系以及跨膜预测分析[15]，研究人员假设 SS 的一部分可能是跨膜的[16];另一方面，Amor等[17]得出结论，SS 不是跨膜蛋白， SS更可能与其他蛋白质相互作用并形成与纤维素合成酶相关的复合物[18-19]。

蛋白质磷酸化对细胞功能起着重要的调控作用，它是蛋白质最重要的翻译后修饰之一[20]。SS 蛋白包含两个磷酸化位点，第一个是11至15处的丝氨酸磷酸化位点，主要在膜缔合中起作用;第二个是170附近的一个丝氨酸，主要参与调节蛋白质降解[21]，这与本研究预测结果（ AhSS2基因的磷酸化位点主要为丝氨酸位点）相符。体内和体外实验表明，蔗糖合成酶蛋白的磷酸化会降低其与膜的关联度[22]。

目前，在蔗糖合成酶基因的克隆、调控机制、生物学功能等分子生物学研究方面均取得了一定的进展，但其参与调控蔗糖分配的机理仍不清楚，还需要做一系列更加深入的研究，方可利用其来调控植物产量和品质。

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（编辑排版：林海妹）