大豆卵磷脂稀释液中添加原花青素对山羊冻精效果的影响

范文华, 戴建军, 张树山, 孙玲伟, 吴彩凤, 张德福*

(1.上海海洋大学, 水产科学国家级实验教学示范中心, 201306 上海; 2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所, 上海农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室, 201106 上海)

精液冷冻是长期保存精子细胞活力的技术手段，后续可通过人工授精恢复畜禽生殖能力。冷冻-解冻过程易造成精子的物理和化学性损伤，在稀释液中添加冷冻保护剂可大大降低这种损伤。卵黄(egg yolk，EY)是哺乳动物精液冷冻稀释液中常添加的保护剂，存在动物源性病原微生物污染的风险，且其成分复杂，不易制备标准浓度的冷冻保护剂[1]。此外，卵黄中含有大量卵磷脂等脂质，导致稀释液粘度增加，抑制精子呼吸并降低精子运动能力[2]。因此，寻求卵黄替代物成为精液冷冻标准化生产的必然趋势。Salmani等[3]研究发现，在山羊精液冷冻中使用大豆卵磷脂替代鸡蛋卵黄，冻后精子活力活率可达33.8%和66.0%，与卵黄组(EY组)的35.4%和67.2%无显著性差异，起到保护冻融后精子免受冷冻损伤的作用。本课题组前期研究发现，2%的大豆卵磷脂可替代卵黄在山羊精液冷冻保存中进行应用，冻后活力和活率可达52.14%和57.44%[4]。

哺乳动物的精子质膜中含有较高浓度的多不饱和脂肪酸，在冻融过程中易氧化应激产生活性氧(reactive oxygen species, ROS)导致脂质过氧化(lipid peroxides, LPO)反应，或生成过量脂质过氧化物丙二醛(malondialdehyde, MDA)导致线粒体的功能障碍，从而影响精子能量代谢，使精子活力下降，受胎率降低[5]。大量研究表明，在精液冷冻稀释液中添加抗氧化剂可抑制LPO反应，改善精子运动能力[6-8]。原花青素(proanthocyanidins, PC)是一种多酚类天然强抗氧化剂，其氧化性优于维生素C和维生素E，能有效清除自由基，抑制ROS的形成，增强抗氧化能力[9]。Attia等[10]研究证实，PC具有清除自由基功能，可减轻雄性小鼠生殖细胞的突变，提高小鼠精子活力。瞿静雯等[11]研究发现，在兔精子获能液中添加1 mg·mL-1PC能有效保护精子质膜和顶体完整性，对精子获能有明显促进作用。孙艳青等[12]研究表明，猪精液超低温冷冻保存中添加40 μg·mL-1PC，精子抗氧化能力得到大幅提高。吕松洁等[13]研究发现，湖羊精液冷冻中添加10 μg·mL-1PC，可有效降低精子氧化损伤，提高冻精质量。

以上冻精研究均在以鸡蛋卵黄为冷冻保护剂的稀释液中添加抗氧化剂，在山羊大豆卵磷脂冷冻稀释液中PC添加的研究报道较少。因此，本研究通过比较添加PC对山羊冻后精子质量、抗氧化指标和凋亡的影响，探究大豆卵磷脂冷冻稀释液中添加PC对山羊冻精中的抗氧化保护作用，为进一步提高大豆卵磷脂在山羊精液冷冻中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和动物

除特别说明外，所有试剂均购自Sigma(美国)公司。

采精用6只崇明白山羊种公羊来源于上海市农业科学院食草动物综合试验站，年龄2～3岁，体格健壮，繁殖性能优良。

1.2 稀释液的配制

基础稀释液的配制：称取柠檬酸1.825 2 g、葡萄糖0.504 4 g和 TRIS 3.634 2 g，溶解后加入200 IU·mL-1双抗(远征药业，石家庄)、6 mL甘油，混匀，定容至100 mL。

试验共分6组，对照组(EY组)为在基础稀释液中添加20.0%(体积分数)卵黄，试验组(SL0、SL1、SL2、SL3和SL4)为在基础稀释液中添加2.0%(质量体积分数)大豆卵磷脂，再添加0、10、20、40、60 μg·mL-1的PC(源叶生物公司，纯度 95%)。

1.3 精液采集及处理

1.3.1精液采集 山羊精液采用假阴道法采集[14]，经常规检测，活力在80%以上可用于后续试验。

1.3.2精液冷冻 将6只种公羊精液混合，按照精液与稀释液1∶3的比例稀释混匀，移入4℃冰箱中缓慢降温平衡2 h。平衡后的样品在4 ℃条件下装入0.25 mL细管，封口后于液氮面上方3 cm处熏蒸15 min，投入液氮保存。

1.3.3精液解冻 从液氮中取出细管样品，迅速放于70 ℃水浴锅中解冻5 s，用稀释液1∶10稀释，37 ℃孵育10 min后进行指标检测。

1.4 精子质量检测

1.4.1精子活力与活率 解冻后精液孵育10 min，轻轻混匀，取10 μL精液滴在预热的迈朗精子计数板中，置于37 ℃恒温载物台上，使用迈朗精液自动分析仪在200×光学显微镜(SJ-TMDI608，迈朗)下随机选取3个视野，计算精子活力和活率。

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1.4.2精子质膜完整率检测 采用低渗肿胀试验法(hypoosmotic swelling test，HOST)检测精子质膜完整性[15]。HOST低渗溶液(0.9 g果糖、0.49 g柠檬酸钠，溶于100 mL双蒸水中)37 ℃预热。取50 μL样品添加到500 μL低渗溶液中，37 ℃水浴1 h，于200×光学显微镜下随机观察3个视野，计算弯尾精子数与总精子数的比例。

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1.4.3精子顶体完整率检测 采用吉姆萨染色法[16]测定精子顶体完整率。解冻后精液使用预热的无甘油基础稀释液50倍稀释，取10 μL滴于载玻片上涂片，风干。甲醇固定，风干后冲洗干净。吉姆萨染色12 h，冲洗干净，风干后于油镜下随机观察3个视野，统计顶体完整染成紫红色精子数和总精子数比例，计算精子顶体完整率。

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1.4.4精子线粒体活性检测 使用罗丹明123(Rh 123)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)双染法检测精子线粒体活性。解冻后精液稀释至1.5×106mL-1，加入10 μL罗丹明123(1 μmoL·L-1)和10 μL碘化丙啶(1 mg·mL-1)混合， 37 ℃避光孵育30 min 后，吸取10 μL样品制片。在400×倒置荧光显微镜(卡尔ZEISS，Axiovert A1)波长520 nm下随机选取四个视野(n≥200)观察，精子呈现红色荧光为死精，精子尾部呈现绿色荧光有线粒体活性[17]，统计精子线粒体活性比率。

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1.4.5精子抗氧化指标检测 使用碧云天的活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)试剂盒，分别检测解冻后精子的抗氧化指标。

1.4.6精子凋亡指标检测 使用CASPACETMFITC-VAD-FMK原位荧光标记试剂盒(Promega公司)和TUNEL凋亡检测试剂盒(碧云天)检测冻后精子总caspase和TUNEL凋亡率。每200 μL精液加入4%多聚甲醛，室温固定1 h。PBS清洗后加入0.1% Triton冰浴2 min，PBS清洗后分别进行凋亡检测。总caspase检测时加入50 μL CASPACETMFITC-VAD-FMK检测液，混匀后37 ℃避光孵育5 min。TUNEL检测时加入50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育1 h。样品经PBS洗涤后悬浮，利用流式细胞仪(贝克曼库尔特，FC500 MPL)测定凋亡精子数，计算凋亡率。

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1.5 统计分析

每组试验重复三次，每次每组至少解冻两管。试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，结果表示为“平均值±标准误”，P< 0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 添加原花青素对山羊冻精质量的影响

由表1可知，添加PC浓度为40 μg·mL-1(SL3组)时，解冻后精子各项指标最高，活率、活力、质膜完整率和顶体完整率分别为58.49%、53.45%、50.46%、55.37%，与未添加PC的EY组(20%卵黄)和SL0组(2%大豆卵磷脂)差异显著(P<0.05)。SL3组质膜完整率与SL2组差异不显著(P>0.05)，但活率、活力和顶体完整率均显著高于SL2组(P<0.05)。当PC浓度增加至60 μg·mL-1(SL4组)时，冻精质量最差，各项指标与EY组(20%卵黄)和SL0组(2%大豆卵磷脂)相比均显著下降(P<0.05)。可见，在大豆卵磷脂稀释液中添加40 μg·mL-1PC可有效提高山羊冻融后精液质量。

表1 不同浓度原花青素下山羊冻精质量Table 1 Quality of goat frozen semen under different concentrations of PC

注：尾部弯曲为质膜完整；尾部未弯曲为质膜不完整。Note：Cured tail means membrane-intact sperm; unbent tail means membrane-damaged sperm.图1 精子尾部卷曲Fig.1 Sperm tail curling

2.2 添加原花青素对冻后山羊精子线粒体活性的影响

添加不同浓度PC对山羊精子冻后线粒体活性影响结果如图3所示。当大豆卵磷脂冷冻保护稀释液添加PC浓度为40 μg·mL-1PC(SL3组)时，解冻后精子线粒体活性显著高于EY组(20%卵黄)和SL0组(2%大豆卵磷脂)(P<0.05)。当浓度增加至60 μg·mL-1(SL4组)时，线粒体活性显著下降(P<0.05)，说明大豆卵磷脂稀释液中添加PC具有浓度效应， 当PC添加浓度为40 μg·mL-1时，解冻后山羊精子线粒体活性得到显著提高。

图2 精子顶体完整性Fig.2 Sperm acrosome integrity

2.3 添加原花青素对山羊冻精抗氧化能力的影响

大豆卵磷脂稀释液中添加PC质量浓度为40 μg·mL-1(SL3组)时，ROS和MDA值最低，分别为0.435和7.03 nmol·L-1，与EY组和SL0组相比差异显著(P<0.05)；SL3组的SOD和GSH-PX值最高，分别为224.87 U·mL-1和129.6 U·L-1，显著高于EY组和SL0组。当添加PC质量浓度至60 μg·mL-1(SL4组)时，SOD和GSH-PX酶活力大幅下降，ROS和MDA值上升，表现为氧化损伤，与EY组和SL0组差异显著(P<0.05)。可见，在大豆卵磷脂稀释液中添加最适浓度外源抗氧化剂PC能有效提高山羊冻精抗氧化能力，减少精子氧化损伤。

注：图中不同字母表示差异显著(P <0.05)。Note:Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P <0.05).图3 精子线粒体活性Fig.3 Mitochondrial activity of sperm

注：图中不同字母表示差异显著(P<0.05)。Note: Different letters in the figure mean significant difference between the treatments (P<0.05).图4 不同浓度原花青素对山羊冻精抗氧化能力的影响Fig.4 Effect of different concentrations of PC on the antioxidant capacity of frozen-thawed goat semen

2.4 添加原花青素对山羊冷冻-解冻精子凋亡的影响

大豆卵磷脂稀释液中添加PC对山羊冻精凋亡影响结果见表2。当PC添加浓度为40 μg·mL-1(SL3组)时，经caspase原位荧光染色和TUNEL检测后流式细胞仪测定精子凋亡率(图5)，总caspase凋亡率和TUNEL凋亡率均最低，且与EY和SL0组冻融精子细胞凋亡率相比差异显著(P<0.05)；继续提高PC添加浓度至60 μg·mL-1(SL4组)时，冻精的凋亡比例迅速增加，与40 μg·mL-1(SL3组)差异显著(P<0.05)。结果说明，当添加PC浓度为40 μg·mL-1时解冻后山羊精子凋亡率最低，对提高精子细胞抗凋亡具有积极影响。

表2 不同原花青素下山羊冷冻-解冻精子凋亡率Table 2 Quality of goat frozen-thawed semen under different concentrations of PC

图5 流式细胞仪检测解冻后精子凋亡率Fig.5 D-plots and histogram analysis of spermatozoa apoptosis rate after thawed

3 讨论

3.1 原花青素的应用对山羊冻精常规品质的影响

本研究在大豆卵磷脂稀释液中添加原花青素(PC)，发现其对提高山羊冻精的抗冻能力具有浓度依赖效应，添加不同浓度PC后冻精品质常规指均有差异。结果显示，添加 40 μg·mL-1的PC能显著提高山羊冻精质量，解冻后精子活力、活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高，分别达58.49%、53.45%、50.46%、55.37%和55.16%，显著高于卵黄组和未添加PC组，这可能是由于PC中的酚性羟基被氧化释放出H+，竞争性的与自由基及氧化物结合，缓解精子细胞氧化应激反应有关。该结果与吕松洁等[13]以卵黄为基础稀释液中的研究结果相一致，其发现10 μg·mL-1的PC可提高湖羊的冻精效果。精子质膜中多不饱和脂肪酸所含双键是维持膜流动性和精子活力所必需的化学键，ROS异常增加可破坏双键，由于精子质膜中缺乏相关细胞质酶，无法修复由ROS引起的损伤，致使脂类化合物聚集，精子活率和活力下降[18-19]。PC作为一种高效抗氧化剂，其高分子结构中的二羟酚基可与金属离子发生络合反应，使自由基失活，减少ROS含量，有效降低线粒体膜和脂质膜的脂质过氧化反应[20]。

3.2 原花青素的应用对山羊冻精抗氧化性的影响

孙艳青等[12]研究表明，猪精液冻存中PC最佳添加浓度为40 mg·L-1;李方舟[21]研究发现，在山羊精液低温保存中葡萄籽原花青素的最适添加浓度为30 mg·L-1。本研究结果显示，添加一定浓度的PC可改善解冻后精子细胞内源性抗氧化酶活性，有效降低ROS和MDA含量，当添加PC浓度为40 μg·mL-1时，SOD和GSH-PX水平最高，ROS和MDA含量最低。PC最适添加浓度不同可能与不同物种稀释液配方和保存方式有关。上述研究均证实PC对精子保存中抗氧化作用有显著提高,这可能与PC的结构和抗氧化保护机制有关。一方面，PC可参与精子质膜磷脂、花生四烯酸的代谢和蛋白质磷酸化，降低脂质过氧化损伤[22]；另一方面PC结构中的酚羟基会在氧化后释放，优先与自由基结合形成惰性化合物，降低精子细胞内MDA含量[23]。这与涂珑珑[24]研究结果相一致，其发现PC可通过降低脂质过氧化水平，缓解小鼠精子由4-硝基酚诱导的毒性损伤和生殖损伤的。SOD和GSH-PX作为哺乳动物精子细胞内抗氧化系统的重要组成部分，SOD可将超氧化物阴离子转化为H2O2和O2，有效清除自由基；GSH-PX可清除ROS，且在DNA损伤的修复中也发挥重要作用[25]。Yousef等[26]研究发现，PC可有效提高细胞中GSH、SOD和CAT(catalase)等抗氧化酶活性，也有研究将大鼠离体组织与PC共浴，结果表明大鼠组织中MDA含量显著下降[27]，与本研究结果一致。

3.3 原花青素的应用对冻融后山羊精子凋亡的影响

Caspase酶家族活化是细胞发生凋亡的中心环节，存在于多数凋亡途径中，对Caspase酶水平的检测来评估精子早期凋亡水平[28]。精子细胞内DNA断裂通常由凋亡异常引起，检测DNA链的完整性是评估精子质量的重要指标，TUNEL法可通过非放射性核素方法检测凋亡晚期过程中DNA断裂情况[29]。本研究在山羊精液冷冻过程中添加40 μg·mL-1PC，解冻后精子细胞caspase凋亡率和TUNEL凋亡比例显著降低，证实了大豆卵磷脂稀释液中添加PC对山羊冷冻精液的抗凋亡保护作用。添加40 μg·mL-1PC组解冻后精子细胞TUNEL凋亡率(41.36%)低于caspase凋亡率(54.33%)，可能是由于冻融后进入早期凋亡的精子细胞较高于中晚期凋亡的精子。而冻精稀释液中添加一定浓度PC后，精子凋亡率明显下降，可能与PC能够降低p53基因表达，增加抗凋亡基因Bcl-2表达含量，从而减少细胞凋亡有关。李华文等[30]研究发现，PC可通过P53和caspase-3途径抑制肝细胞非正常凋亡，调节细胞存活率，这与本研究结果一致。

有关花青素毒性和安全性研究报道较少。瞿静雯等[11]研究PC对兔精子获能发现，当PC的添加浓度大于1.0 mg·mL-1时，导致精子顶体反应率下降。本研究中增加PC浓度至60 μg·mL-1后，PC开始表现为对精子的毒副作用，表现为解冻后精子活率、活力、质膜完整性和顶体完整率下降。可能与高浓度的PC添加打破了精子细胞内氧化-抗氧化平衡系统，引发过度氧化应激，诱导精子细胞构象和完整性发生不可逆损伤有关。

综上所述，在山羊精液冷冻过程中，PC在大豆卵磷脂稀释中的添加具有浓度依赖效应，40 μg·mL-1的PC对山羊冻精有显著抗氧化保护作用，可通过降低氧化损伤和细胞凋亡、提高线粒体功能，从而达到提高冷冻效率的目的。高浓度的PC则表现为对冷冻精液的毒性作用。