基于呼出气体检测口臭等级的电子鼻研究*
2021-09-29薛莹莹陈远涛熊忆舟于伟杰张钧煜张若彤
张 涛，薛莹莹，陈远涛，熊忆舟，于伟杰，张钧煜，万 浩，张若彤，叶 玮，王 平*
(1.浙江大学生物传感器国家专业实验室，生物医学工程教育部重点实验室，生仪学院，浙江 杭州 310027；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海 200011)
口臭是指从口腔中散发出的令人不愉快或令人讨厌的气味，严重影响个人的社交活动[1]。已有研究表明，口臭的发病率在30%以上[2]，多达85%的病例是由牙周炎、牙龈炎或厚舌苔等口源性因素导致[3]。当口腔卫生或健康状况出现问题时，革兰氏阴性菌等厌氧细菌会大量增殖，通过分解含硫氨基酸产生挥发性含硫化合物(Volatile Sulfur Compounds，VSCs)导致口臭[4]。其中硫化氢和甲硫醇作为口源性口臭的标志物已经被逐渐地应用于临床上对口臭的评估[5]，因此检测口腔内这两种挥发性硫化物的种类和浓度，对口臭的诊断及进一步治疗有重要的意义。
当前口臭的诊断方法主要包括感官评分法，气相色谱法，便携式气相色谱仪和便携式硫化物检测仪等[6]。其中感官评分法是利用人的嗅觉器官-鼻子来评价口臭的强度，被认为是口臭检测的金标准，目前国内外应用最广泛的为20世纪90年代Rosenberg提出的0~5分制感官评分标准，将口臭严重程度分为了6个等级[7]。但由于不同个体甚至是同一个体在不同状态下嗅觉敏感度是有差异的，因此就有必要对辨嗅员进行培训，以达到统一标准。气相色谱法能对口腔呼出气体中的VSCs进行定性和定量分析，适用于需要精确知道VSCs种类和浓度的场合，但因设备昂贵、操作复杂，在临床上的应用并不常见。便携式气相色谱仪“Oral Chroma”以空气作为载气，能同时测量硫化氢、甲硫醇和二甲基硫三种硫化物的浓度；便携式硫化物检测仪“Halimeter”只能测量出口腔中VSCs的总浓度，无法区分硫化物的种类。作为商用的口臭诊断仪器，便携式气相色谱仪和硫化物检测仪因为价格较高、便携性差等因素，其使用范围只能局限于口腔门诊。
口臭会对个人形象带来严重的负面影响，而不少口臭患者却没有意识到自己患有口臭。随着人们社交活动越来越频繁，设计一种具有个人或家庭使用前景的口臭标志物检测及口臭等级判别的电子鼻具有重要的现实意义。本研究利用气相色谱与质谱联用技术(Gas Chromatography-Mass Spectroscopy，GC-MS)建立了基于口腔呼出气体中VSCs检测的标准化流程，分析了GC-MS测量结果与感官评分的关系并确定了不同感官评分间的VSCs浓度阈值。并以GC-MS的检测结果作为传感器筛选的前提，在此基础上设计了一套用于口臭标志物定量检测及口臭等级判别的电子鼻系统。
1 材料和方法
1.1 实验材料和仪器
实验过程使用的材料及仪器包括:100 mL Tedlar采样袋，GC-MS(QP2010 Plus，岛津，日本)，GS-GasPro色谱柱(30 m×0.32 mm，安捷伦，美国)，气密性进样针(1 mL，岛津，日本)，配气仪(Gas Blender 100 Series，MCQ Instruments，意大利)，硫化氢标准气体(1.06×10-7mol/mol)，甲硫醇标准气体(1.04×10-7mol/mol)，二甲基硫标准气体(1.0×10-7mol/mol)，高纯氦气(99.999%)，标准空气。
1.2 实验过程
1.2.1 口腔检查
口腔检查过程在上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔预防科进行。受试者的入选标准为:①未患有全身系统性疾病的成年就诊者；②受试前三个月未进行牙周治疗，包括预防性洁治、龈下刮除和牙周手术；③受试前两周内没有抗生素服用史。所有受试者在接受检查前未使用嗽口水、抽烟、饮酒及食用洋葱、大蒜等辛辣食物，口腔检查过程在上午8:30~12:00间进行。
牙科医生对入选标准内的就诊患者进行了口腔健康检查和感官评分。口腔健康检查主要查看受试者是否患有牙龈炎、牙周炎或厚舌苔。感官评分由训练有素的辨嗅员对受试者的口臭等级作出评价，操作步骤为:受试者口含长度为10 cm的一次性医用无菌吸管的一端，吸管的另一端穿过屏风中间的小孔到达辨嗅员鼻前约2 cm~3 cm处。测试时受试者先紧闭双唇1 min，然后缓慢呼气，辨嗅员根据闻到的气味给出感官评分。采用0~5分制感官评分标准对口臭严重程度进行等级量化:0分表示无口臭；1分表示几乎没有明显的口臭；2分表示轻微但能明显闻到的口臭；3分表示中等程度的口臭；4分表示强烈的口臭；5分表示非常难闻的口臭。
1.2.2 口气样本采集及GC-MS检测的标准化流程
Tedlar采样袋在使用前经过了老化处理，以消除背景对检测结果的影响。口气样本采集时首先将一次性无菌特氟龙管的一端与Tedlar采样袋的进气口连接，受试者口含特氟龙管的另一端并紧闭嘴唇30 s，然后缓慢打开采样袋的阀门，受试者平稳呼吸，通过特氟龙管向采样袋内缓慢呼气，待收集满100 mL口气样本后立即关闭采样袋的阀门。一个成人每次呼吸会排出约500 mL气体，其中前150 mL气体是来自上呼吸道和鼻咽，后350 mL气体来自肺部[8]，因此采集到的100 mL口气样本基本不会受到肺泡气的干扰。每个采样袋上会注明该患者的就诊信息及感官评分。
检测时GC柱温箱的起始温度设置为80℃，以40℃/min的升温速率将柱箱温度升至220℃，并在该温度下保持2 min；采用分流进样方式，分流比设置为4，进样口的温度设置为100℃；流量控制方式设置为恒压模式，柱流量设置为2.59 mL/min，吹扫流量设置为3 mL/min。MS离子源的温度设置为200℃，接口温度设置为250℃，轰击电子能量设置为70 eV；采用SIM模式进行检测，硫化氢、甲硫醇和二甲基硫的定量离子分别为m/z＝34、m/z＝47和m/z＝62，整个检测程序的运行时间为5.5 min。
气体样本进行分析时首先将容量为1 mL的气密性进样针扎进采样袋，来回推拉进样针的活塞3次，以去除死腔气体；然后抽取1 mL样本，迅速转移至GC进样口，匀速推挤活塞直至全部气体进入GC中；最后点击GC面板的“Start”按钮后仪器便开始分析。从总离子流图(图1)中可知硫化氢、甲硫醇和二甲基硫的保留时间分别为1.50 min、3.05 min和4.85 min。
图1 硫化氢、甲硫醇和二甲基硫的总离子流图
采用外标法对口气样本中的VSCs进行定量分析，三种硫化物的标准曲线如图2所示，由图可知标准曲线具有良好的线性度(R2>0.995)。对检测方法进行回收率和精密度实验，结果显示三种硫化物的回收率在92%~97%之间，相对标准偏差(RSD)<6%，表明本文所建立的使用GC-MS对口气样本中的硫化氢、甲硫醇和二甲基硫进行定量检测的方法是可行的。
图2 硫化氢、甲硫醇和二甲基硫的标准曲线
2 临床结果分析
2.1 临床样本统计
本文研究时共采集了102例临床样本，详细信息如表1所示。
表1 临床样本的基本信息
102例患者口气中的VSCs浓度(硫化氢、甲硫醇和二甲基硫的浓度和)分布在2×10-9~2 569×10-9之间，浓度值的中位数和四分位间距分别为159×10-9和277×10-9，感官评分范围在0~4分之间，共5个等级。
感官评分是基于口腔呼出气体中VSCs及其他致臭气体给人嗅觉系统造成不愉悦程度的一个综合评价。已有研究表明，没有一种纯粹的气体具有口臭的特征，实际的口腔异味由多种气味分子组成，产生主要和次要的气味[9]。进一步地，采用Spearman相关分析法对GC-MS的测量结果与感官评分之间的相关性进行分析，统计结果见表2。由统计结果可知GC-MS测量的硫化氢、甲硫醇以及VSCs浓度均与感官评分呈显著正相关(P<0.05)，而二甲基硫浓度与感官评分之间不具有显著相关性(P>0.05)。VSCs为三种硫化物的浓度和，若以VSCs*表示硫化氢和甲硫醇的浓度和，其与感官评分的相关系数明显大于VSCs与感官评分的相关系数，表明口腔中存在的二甲基硫不是导致口臭的主要因素，因此可以将硫化氢和甲硫醇的浓度和作为评价口臭严重程度的指标。此外，硫化氢浓度与感官评分的相关系数大于甲硫醇浓度与感官评分的相关系数，表明硫化氢是比甲硫醇更为关键的致臭气体。
表2 GC-MS测量的各指标与感官评分相关性分析
2.2 不同感官评分间的VSCs浓度阈值
本文采用受试者工作曲线分析方法确定不同感官评分间的VSCs浓度阈值。受试者工作曲线(Receiver Operating Characteristic Curve，简称ROC曲线)又称为ROC曲线，广泛应用于生物医学研究中以评估诊断的准确性。在二分类问题(例如“有病”或“无病”)中，诊断测试的决定通常基于某标记物是否超过阈值。对于未患病的个体，诊断测试可能给出阳性结果，而对于患病的个体则可能给出阴性结果，灵敏度定义为患病个体被正确预测为患有疾病的概率，特异性定义为未患病个体能被正确预测为阴性的概率。这些概率随标记物阈值的变化而改变，ROC曲线针对所有可能的阈值绘制出灵敏度和1-特异度曲线，并通过ROC曲线下面积(AUC)来评估诊断效果[10]。当AUC＝0.5时，表示诊断结果与随机猜测一样，没有价值；当0.5
定义变量n和m，其中n表示感官评分值，m＝(2n＋1)/2。前面的分析已经表明二甲基硫不是导致口臭的关键因素，因此后面提到的VSCs仅代表硫化氢和甲硫醇的浓度和。使用ROC曲线分析方法确定感官评分n分和n＋1分间的VSCs浓度阈值时，将102个临床样本中感官评分值小于m的样本定义为一类，大于m的定义为另一类。例如确定感官评分0分和1分间的VSCs浓度阈值时，将评分为0分的样本定义为一类，感官评分为1~4分的样本定义为另一类，在ROC曲线上通过寻找约登指数最大的点来确定最佳的浓度阈值。由图3可知采用ROC曲线分析方法对GC-MS测量的VSCs浓度值进行阈值划分时，ROC曲线均在参考线上方且AUC有意义(P<0.05)。除了在确定感官评分为2分和3分间的阈值时AUC小于0.8，在其余三个阈值处都表现出了较高的诊断价值，尤其是在确定3分和4分间的阈值时其AUC大于0.9，表现出了极好的诊断价值。表3列出了不同感官评分间的VSCs浓度阈值。
图3 不同感官评分间VSCs浓度阈值的ROC曲线分析结果
由于感官评分的评价主体是人，即便辨嗅员经过严格训练，在评价口臭的严重程度时仍存在一定主观性，尤其是对0分和1分的评估容易互相交叉。从Rosenberg量表的描述来看，0分和1分给嗅觉系统带来的感受几乎没有区别，因此临床上通常将感官评分为0分和1分的患者定义为无口臭，感官评分大于1分的患者定义为有口臭。按照本文的分析结果(表3)，如果测量的VSCs浓度超过155×10-9时，那么可以认为该患者患有口臭，这一阈值非常接近Halimeter生产厂商提供的诊断口臭的阈值(110×10-9)。
表3 不同感官评分间VSCs浓度阈值的诊断效果
3 电子鼻系统
3.1 电子鼻系统的设计
由前面分析可知口臭患者呼出气体中VSCs浓度在ppb级别，因此对传感器的检测下限、灵敏度、分辨率和特异性有极高的要求。导致口臭的关键恶臭气体为硫化氢和甲硫醇，对二元混合气体的定量分析，至少需要两个气敏特性不同的气体传感器[12]，因此本文选择一个硫化氢和一个甲硫醇电化学传感器组成传感器阵列。电子鼻通过特氟龙接口与Tedlar采样袋的进气口连接，并通过电磁阀控制气路的切换实现检测和清洗。电子鼻系统功能实现流程如图4所示。
图4 电子鼻系统的软硬件流程图
恒电位电路使电化学传感器的参比电极与对电极保持固定的压差，以提高传感器的选择性及输出信号的稳定性。传感器与痕量的硫化氢或甲硫醇发生反应产生氧化电流，经过I/V转换电路后被转换成电压信号，进而通过放大和滤波电路实现信号调理。微处理器的ADC将经过调理的电压信号转换为数字信号并通过串口发送到PC端的数据采集软件，至此便能获取电子鼻的输出响应谱图。呼吸谱图是一系列传感器响应的结果，电子鼻经过训练后可以通过模式识别算法对呼出气体中的VSCs进行定性和定量分析。
由于本文对痕量物质的检出能力和定量能力很重视，因此仪器检出限是评价电子鼻性能的核心参数。电子鼻的检出限是指目标气体在给定的置信区间(可接受的精密度与正确水平)能区别于仪器噪声被定性检出的最低浓度或含量。由前面GC-MS测量的结果可知，口腔呼出气体中VSCs浓度在ppb级别，因此电子鼻的检出限对口气中痕量VSCs的识别至关重要。
采用三倍噪音值法计算检出限，即利用已知低浓度样品与空白样品的测量信号进行比较，当被测样品的响应等于空白测量响应标准偏差的三倍时，此时被测样品的浓度或含量便为仪器的检出限，计算公式如下:
式中:DL表示仪器检出限，N表示经过多次测量的空白响应标准偏差，k表示传感器在低浓度范围时标准曲线的斜率。
利用配气仪将原始浓度的硫化氢(1.06×10-7mol/mol)和甲硫醇(1.04×10-7mol/mol)标准气体稀释成所需的浓度，分别测试电子鼻对这两种气体的检出限。图5(a)为通入10s浓度为50×10-9的硫化氢与空白响应的对比，可见当硫化氢浓度为50×10-9时，传感器响应值明显高于三倍空白响应的标准偏差。将标准曲线的斜率及经过多次测量的空白响应标准偏差代入上述计算式，可知电子鼻对硫化氢的检出限为39×10-9；采取同样的测试方法可知电子鼻对甲硫醇的检出限为48×10-9。
呼出气体中含有成分复杂的挥发性含氮化合物及挥发性有机化合物，本文所使用的电化学传感器理论上只对含硫的还原性气体交叉敏感，为了验证所使用的电化学传感器是否具有优异的特异性，使用远高于正常人呼吸背景浓度的氨气和乙醇对电子鼻进行测试。测试时，硫化氢和甲硫醇的浓度为50×10-9，乙醇和氨气的浓度为5 000×10-9，图5(b)为甲硫醇传感器在四种气体下的响应电压曲线，可知即便氨气和乙醇等干扰气体的浓度为目标气体的100倍，但其响应仍远小于接近检出限浓度的目标气体，表明所使用的电化学传感器具有优异的特异性。
图5 电子鼻的性能测试
3.2 电子鼻系统的定量分析
常规的模式识别算法通常需要进行复杂的预处理以提取特征，而卷积神经网络可以直接从输入的原始数据中提取特征，不需要进行复杂的预处理[13]。一维卷积神经网络能从较短的数据片段中提取有用的特征值[14]，很适合应用于一维传感器信号的分析，因此本文采用一维卷积神经网络实现气体的定性和定量检测。
在电子鼻的定量算法模型构建时，配制了7个浓度水平的VSCs(100×10-9、200×10-9、400×10-9、600×10-9、800×10-9、1 000×10-9、1 200×10-9)混合气体样本，每个VSCs浓度下甲硫醇和硫化氢设置9个不同的浓度比值(1∶0，4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，0∶1)，每个浓度比值重复测量三次，采集电子鼻的输出响应谱图，因此共有7×9×3＝189个用于训练的样本。
本文设计的一维卷积神经网络的结构由输入层、3个卷 积 模 块(Conv1D＋Batch Normalization＋ReLU)、3个一维最大池化层(Maxpooling1D)、一个全局最大池化层(Global Max Pooling，GMP)和2个全连接层(Fully-Connected，FC)构成(如图6所示)。对采集的响应谱图去除基线后进行10倍降采样，每个波形截取295个点，然后将每个比值下的一组波形拼接成一个1×590的一维数组作为神经网络的输入信号。将三种不同大小的卷积核应用于卷积层，三个卷积核的大小分别为1×7，1×5和1×3，步长为1，每个卷积层后连接一个一维最大池化层进行数据降维。全局最大池化层用来汇合卷积层提取的特征，其后与全连接层相接，对64个特征进行合适的变换并与标签之间进行回归计算。y为每个输入信号的标签，其中y1和y2分别表示甲硫醇和硫化氢浓度。
图6 构建定量算法的一维卷积神经网络结构示意图
利用配气系统配制300×10-9、500×10-9、700×10-9和900×10-9四个浓度水平的VSCs对电子鼻进行测试，每个VSCs浓度下甲硫醇和硫化氢设置3个浓度比值(1∶2，2∶1，1∶1)，每个比值测量三次并获取电子鼻的输出响应谱图。将36个测试集的响应曲线谱图输入定量算法模型进行计算，利用式(2)计算预测值和实际值之间平均相对误差，结果显示模型计算出的VSCs(硫化氢和甲硫醇的浓度和)浓度和实际值之间的平均相对误差为6.2%。
上式中AVE_E表示平均相对误差，N表示测试样本的个数，表示第i个样本的预测结果，表示第i个样本的实际浓度值。
进一步地，从临床上采集20个口气样本同时进行GC-MS和电子鼻定量检测，以GC-MS的测量结果作为金标准，将电子鼻的检测结果与GC-MS的检测结果进行比较，结果表明该电子鼻检测实际临床样本中VSCs浓度的平均相对误差为11.4%。本文第3.2节通过ROC曲线分析方法确定了不同感官评分间的VSCs浓度阈值，从而获取每个感官评分的VSCs浓度范围，当电子鼻完成实际样本检测后，可以根据其VSCs浓度所处的范围确定该样本的感官评分。每个采样袋上事先标注了辨嗅员给出的感官评分，以该评分作为金标准时，将电子鼻的评分与辨嗅员的感官评分进行对比，结果显示电子鼻对口臭等级判别的正确率为80%。由于实际样本中VSCs浓度极低，且背景成分极其复杂。与此同时，硫化氢和甲硫醇极易吸附在电子鼻的气路中，从而增大检测值与实际值的偏差，但11.4%的平均相对误差和80%的口臭等级判别正确率已经能足够表明该电子鼻具有良好的定量及口臭分级作用，可以替代辨嗅员对口臭患者进行感官评分。
3 结论
本文利用GC-MS对呼出气体中的VSCs进行了定性和定量检测，通过相关性分析表明VSCs浓度值可以作为评估口臭等级的指标，结合ROC曲线分析方法确定了不同感官评分的VSCs浓度范围。在GC-MS测量结果的基础上，研制了一套基于电化学传感器并结合卷积神经网络模型的电子鼻，该电子鼻对硫化氢和甲硫醇的检出限分别为39×10-9和48×10-9，并具有优异的抗干扰性能。本电子鼻检测已知浓度的标准品时候，测量结果和实际浓度之间的平均相对误差为6.2%。实际口气样本检测时，与GC-MS检测结果比较，该电子鼻检测实际临床样本中VSCs浓度的平均相对误差为11.4%；以辨嗅员给出的感官评分作为金标准，该电子鼻对口臭等级判别的正确率为80%。
当前临床上通过口臭检查辅助诊断口源性与非口源性疾病的研究得到了越来越多的重视，但仅对口臭进行分级还不能有效地诊断疾病。进一步的研究将对口臭患者和健康人的唾液以及舌苔中微生物的代谢组学进行分析，筛选出潜在的口臭及口源性疾病的生物标志物，并结合电子舌技术，研制对这些潜在标志物具有特异性的传感器。最终采用多传感器融合算法对电子鼻与电子舌数据同时分析，建立更加准确的口臭及口源性疾病诊断模型。
