塔尔米抗氧化饼干配方优化及对果蝇II型糖尿病模型降糖作用的影响

吴飞虎，敬思群 ，王德萍

（1.韶关学院英东食品学院，广东韶关 512005；2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046）

随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，我国的糖尿病患病率逐年升高[1]，糖尿病已经成为肿瘤和心脑血管疾病之外的第三大慢性非传染疾病[2−3]。近年来功能性食品防治糖尿病的研究备受关注，植物因其具有低毒、高效、低副作用、多靶点[4−5]的优势，已在饼干[6−7]、面包[8]、面条[9−10]、酸奶[11−12]等具有降糖活性的功能食品上得到广泛应用。

糜子米（Panicum miliaceumL）又名塔尔米，为禾本科，其色泽金黄、颗粒饱满，是一种大小介于大米和小米之间的米作物，俗称“中米”。塔尔米的生长周期短、产量高，主要有氨基酸、多肽、蛋白质、多糖、有机酸、皂甙、酚类、黄酮、内酯、香豆素、萜类及甾体类、等化学成分，具有预防高血压、高血脂、糖尿病等优点[13]。山楂（Crataegus pinnatifida）中主要含有有机酸、黄酮类、花色苷类、三萜类等多种抗氧化活性化合物，具有降糖降脂作用[14−17]。糙米是稻谷加工去壳后仍保留皮层、胚乳和胚的全谷粒。糙米中矿物质、维生素和膳食纤维等含量较高，是一种天然的营养健康食品[18]。目前已有山楂和糙米所制得的功能性食品，如代餐粉、饮料等。袁嘉渝等[19]利用糙米、紫米、红米、大米、玉米等谷物为原料，辅加山楂、薏苡仁、山药、莲子、赤小豆、黑豆等药食同源物质，研制出具有丰富营养成分的代餐粉；杨天意等[20]以发芽糙米和香蕉为主要原料，加入山楂、木糖醇研制出兼有发芽糙米和香蕉风味的固体营养饮料。但是尚未见以塔尔米、山楂和糙米为原料研制的饼干的降糖作用的研究报道。

果蝇（Drosophila melanogaster）的胰岛素代谢与人类有着相似性，近年来利用果蝇研究代谢性疾病的发病机制成为热点。与其它动物模型相比，果蝇具有繁殖快、周期短、饲养容易、成本低，更易做群体分析的优点，是研究产品与II型糖尿病作用机制的理想生物模型[21]。张亚明等[22]将菊粉添加到以小麦粉和塔尔米粉为原料制成的速冻熟制拉面中，以果蝇为模型，探讨塔尔米菊粉速冻熟制拉面对糖脂代谢的影响，结果表明添加了菊粉和塔尔米的速冻熟制拉面能极显著降低高糖及高脂诱导的II型糖尿病果蝇的海藻糖及甘油三脂含量，且塔尔米和菊粉有协同辅助降糖降脂作用。许子杨等[23]以黑檀体果蝇为试验动物，分析了石斛粉葛咀嚼片对高糖及高脂诱导的果蝇II型糖尿病模型的降糖降脂作用，结果表明石斛粉葛组能极显著降低甘油三酯及海藻糖含量，具有较好的降糖降脂作用。本实验以塔尔米、山楂和糙米为原料，以饼干的质构特性、抗氧化活性及感官评价为指标，通过单因素和正交试验确定塔尔米饼干的最佳配方，并在此基础上进行了抗氧化实验和降糖果蝇实验以评价塔尔米饼干的抗氧化活性和降糖作用，在增加饼干新品种的同时为糖尿病患者的辅助治疗提供一种新型的功能性食品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

塔尔米 托里县达尔汗农产品购销农民专业合作社；85型菊粉（甜味剂） 固体含量≥85%，正生营养科技（北京）有限公司；小麦粉 低筋面粉，面筋含量16.08%，新疆阿尔曼清真食品工业集团有限公司；山楂、糙米、植物油、小苏打、加碘盐、玉米淀粉和碳酸氢铵等 均购买于市场；普通饼干 以小麦粉为主要原料，参考潘阳[24]方法由实验室自制；DPPH天津市化学试剂三厂；ABTS 上海华蓝化学科技有限公司；α-淀粉酶 活力≥3700 U/g，北京奥博星生物技术有限责任公司；蔗糖（分析纯)、麦芽糖（分析纯)、对羟基苯甲酸甲酯、丙酸、石油醚（沸程30~60 ℃）、抗坏血酸（VC）、0.1%二甲双胍 韶关市威尔生物科技有限公司；甘油三酯、海藻糖、总蛋白含量测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；雄性黑檀体果蝇（Ebony Flies） 由新疆大学生命科学与技术学院阿里木老师提供；普通培养基、高糖培养基 实验室自制（参考段寅慧[21]方法）。

Al-104分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；FW135中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHE-3000G全波长多功能酶标仪分析仪、V-1100D可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；TMSPRO质构仪 美国FTC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 塔尔米饼干的制作

1.2.1.1 工艺流程

1.2.1.2 操作要点 原料处理：塔尔米粉：将塔尔米清理去杂后用中草药粉碎机粉碎过80目筛制得塔尔米全粉，后按照10:1的比例加入α-淀粉酶，混合均匀后加入适量蒸馏水，于55 ℃恒温水浴锅中处理30 min，后升温至85~90 ℃使酶灭活，经离心去水，干燥，重新粉碎过80目筛制得；山楂粉、糙米粉：由市场所购的山楂和糙米经充分干燥后由中草药粉碎机粉碎过80目筛制得。

辅料及配比：参考潘阳[24]方法，即植物油、菊粉、淀粉、食盐、小苏打、碳酸氢铵分别占混合粉添加量的10%、10%、3%、0.5%、0.8%、0.4%。

将准备好的山楂粉、糙米粉、菊粉、植物油、淀粉、食盐、小苏打、碳酸氢铵溶于适量水后加入混合粉（塔尔米粉和面粉）中调制。

和面：用温水和面，温度维持在37 ℃左右。

醒发：在37 ℃下醒发10 min。

辊压：将面团分成若干块，压至成厚度1 cm、表面光滑的圆面片。在辊轧时注意要多次折叠并旋转90°，且使用擀面杖要用力均匀。

成型：在完成辊压后的面胚上扎上均匀的小孔，然后用刀将其分为长5 cm、宽4 cm的面块，在已预热的烤盘上均匀地涂抹少量食用油，后将饼片放入烤盘中。

烘烤：将烤盘放入已预热后（面火190 ℃、底火175 ℃）的烤箱中，焙烤约10 min。

冷却：室温下冷却。贮藏温度5~26 ℃，湿度40%。

1.2.2 原料粗细度对饼干品质的影响 将塔尔米、山楂、糙米粉碎，利用不同目的筛网进行过筛，得到40、60、80目不同粗细的粉，分别根据韧性饼干的基础配方[21]制作出相应产品，利用质构仪对不同粗细度原料制作的饼干进行测定，选取硬度、脆度和弹性并结合感官评价进行分析，确定最适原料粗细度。

1.2.3 塔尔米饼干配方单因素实验

1.2.3.1 塔尔米粉配比对塔尔米饼干抗氧化能力的影响 混合粉的总添加量为100 g，其中将塔尔米粉与小麦面粉的质量比分别设为0:100、50:50、55:45、60:40、65:35五个水平，山楂粉添加量为8%，糙米粉添加量为6%，按照工艺1.2.1进行焙烤制成饼干，以ABTS+、DPPH自由基的清除率的IC50值为指标，确定最适塔尔米粉添加量。

1.2.3.2 山楂添加量对塔尔米饼干抗氧化能力的影响 山楂粉添加量分别设为4%、6%、8%、10%、12%五个水平，塔尔米粉与小麦面粉质量比为55:45，糙米粉的添加量为6%，按照工艺1.2.1进行焙烤制成饼干，以ABTS+、DPPH自由基的清除率的IC50值为指标，确定最适山楂粉添加量。

1.2.3.3 糙米粉添加量对塔尔米饼干抗氧化能力的影响 糙米粉添加量分别设为4%、6%、8%、10%、12%五个水平，塔尔米粉与小麦面粉的质量比为55：45，山楂粉的添加量为8%，按照工艺1.2.1进行焙烤制成饼干，以ABTS+、DPPH自由基的清除率的IC50值为指标，确定糙米粉最适添加量。

1.2.4 塔尔米饼干配方正交试验 选用L9（34)正交试验优化塔尔米饼干配方。分别测定各组样品的感官评分、DPPH自由基清除率的IC50值、ABTS+自由基清除率的IC50值以及总抗氧化能力，以多指标综合加权评分法确定鲜面条配方的最优组合。正交试验因素水平见表1。

表 1 正交试验因素水平设计Table 1 Factor and level of orthogonal test

1.2.5 感官评价 结合饼干的口感、硬度、脆度、色泽和外形5个方面的特点，制定出加权感官评分表见表2。随机选取10名食品专业的学生（男女比为1:1）为感官评价评分员，采用综合评价法，对产品进行评价。

1.2.6 综合评分法确定塔尔米饼干最优配方 综合评分法是先分别按不同指标的评价标准对单个评价指标进行评分，然后采用加权相加，综合所有指标求得总分[25−26]。不同指标得分标准见表3，感官评价权重为0.2、ABTS+自由基清除能力权重为0.3、DPPH自由基清除能力权重为0.3、总抗氧化能力权重为0.2。综合评分=感官评价分值×感官评价权重+DPPH自由基清除能力分值×对应权重+总抗氧化能力分值×对应权重+ABTS+自由基清除能力分值×对应权重。

表 2 加权感官评分标准Table 2 Weighted sensory scoring criteria

1.2.7 质构特性测定 参考任顺成等[27]的方法并加以改动，利用质构仪测定塔尔米饼干的硬度、脆性和弹性。测试条件：TPA模式，P 0.5探头，测试前速率1.0 mm/s，测试速率5.0 mm/s，测试后速率5.0 mm/s；压缩程度50 %；触发力5 g。

1.2.8 体外抗氧化活性的测定

1.2.8.1 样品的处理 将塔尔米饼干和普通饼干用粉碎机粉碎，过40目筛，用2~3倍体积的石油醚浸泡放置过夜脱脂，抽滤去除石油醚，留取样品，在室温下晾干备用。称取定量的样品，用去离子水配制成浓度分别为2、4、6、8、10、12 mg/mL的样液，将抗坏血酸用去离子水配制成同样浓度梯度的溶液，待用。

1.2.8.2 DPPH自由基清除能力的测定 参照Ajiboye等[28]的方法，取各浓度塔尔米饼干样液2 mL，分别加入2 mL 2×10−4mol/L的DPPH乙醇溶液，摇匀，室温下反应30 min，于517 nm波长处测定吸光值A1，对照组以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液（A2），空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液（A0），以普通饼干为对照，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，根据如下公式计算DPPH自由基清除率，结果用IC50值体现。IC50值是清除50%自由基所需样品的浓度，IC50与样品清除自由基的能力成负相关，即IC50越小，表明样品清除自由基的能力越强，反之亦然。

式中：A1：样品组吸光值；A2：对照组吸光值；A0：空白组吸光值。

1.2.8.3 ABTS+自由基清除能力的测定 参照梁红敏等[29]方法，将2.2’-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐（ABTS）用蒸馏水配制成7.4 mmoL/L溶液。取0.2 mL上述溶液与0.2 mL 2.6 mmol/L K2S2O8溶液混合均匀，避光放置12 h后，稀释40~50倍，用磷酸盐缓冲液（pH6.6）将ABTS溶液稀释至吸光度为0.70±0.02得到工作液。取各浓度塔尔米饼干样液0.2 mL分别加入1.9 mL ABTS工作液混匀，振荡10 s，静置6 min后，于波长734 nm处测定吸光度A1，对照组以等体积无水乙醇代替工作液（A2），空白组以等体积蒸馏水代替样品溶液（A0），以普通饼干为对照，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，根据下式计算ABTS+自由基的清除率，结果用IC50值体现。

式中：A1：样品组吸光值；A2：对照组吸光值；A0：空白组吸光值。

1.2.8.4 总抗氧化能力的测定 参照Kaur等[30]所述测量样品总抗氧化能力的方法，精确吸取不同浓度塔尔米饼干样液1 mL，分别加入2.5 mL pH6.6的磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，混合后在50 ℃放置20 min，加入2.5 mL 10%TCA（三氯乙酸）溶液混合后，吸取2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.1% FeCl3溶液2.5 mL，混匀，室温下静置10 min，在700 nm处测定吸光度（A）。以试剂作为空白对照，测定吸光度A0，以普通饼干为对照，以抗坏血酸（VC）为阳性对照，根据下式计算总抗氧化能力，用WA表示：

式中：A：样品组吸光值；A0：空白组吸光值。

1.2.9 塔尔米饼干对果蝇II型糖尿病模型降糖作用的影响 参照段寅慧[21]的方法，设正常对照组、模型组、阳性对照组和产品组。将三日龄雄性果蝇随机分组，其中正常对照组的果蝇使用普通的果蝇培养基，其他果蝇使用高糖培养基孵育1周后，再分别随机分为模型组、阳性对照组、产品低剂量组、产品高剂量组，分别给药1周后按试剂盒方法测定总蛋白、甘油三酯和海藻糖的含量。其中阳性对照组是在普通培养基中，加入重量为培养基重量0.1%的二甲双胍；果蝇进食量实验表明[22]，1%给药浓度组与普通培养基组相比差异性最小，5%给药浓度组与普通培养基组相比差异性最大，故将产品低剂量组给药浓度设为1%，将产品高剂量组给药浓度设为5%，即在普通培养基中加入重量为培养基重量1%、5%的饼干（将饼干碾碎，加入培养基中混匀）。果蝇模型试验分组详见表4。

1.3 数据处理

表 3 指标分值分配Table 3 Allocation of index and score

表 4 塔尔米饼干分组Table 4 Ta-er-mi biscuit group

2 结果与分析

2.1 原料粗细度对饼干品质的影响

由图1可知，原料过80目筛后制作的饼干其硬度、脆性与弹性大小都在原料过40目与60目筛后制作的饼干之间，结合感官评价结果表明过40目筛的原料制作的塔尔米饼干颜色不均匀，较黏牙；过60目筛的原料制作的塔尔米饼干口感较干，颗粒感较明显，难以咀嚼；过80目筛的塔尔米饼干色泽均匀，软硬适中，口感细腻，比过40目与60目筛制作的塔尔米饼干更易被接受，因此，确定80目为制作塔尔米饼干的原料粗细度。

图 1 原料粗细度对饼干品质的影响Fig.1 Influence of raw material thickness on biscuit texture

图 2 单因素实验结果Fig.2 Results of single factor experiment

2.2 单因素实验结果

由图2a可知，塔尔米与小麦粉质量比为60:40时DPPH、ABTS+自由基清除能力的IC50值达到最低，分别为3.74±0.96、1.30±0.17 mg/mL，即塔尔米与小麦粉质量比为60:40时，塔尔米饼干对DPPH、ABTS+自由基清除能力最好。由图2b可知，山楂粉添加量为8%时，DPPH由基清除率的IC50值达到最低，为1.28±0.47 mg/mL，ABTS+自由基清除能力的IC50值为14.53±1.19 mg/mL，仅大于添加量为4%时的11.71±0.80 mg/mL，而当山楂粉添加量为4%时，其DPPH自由基清除率的IC50值为最大值8.50±0.61 mg/mL，所以8%为山楂粉最适添加量。由图2c可知，糙米粉添加量为8%时，DPPH、ABTS+自由基清除率的IC50值达到最低，分别为10.46±3.75 mg/mL、1.740±0.88 mg/mL，即糙米粉添加量为8%时，DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力最好。综上，单因素实验结果选择塔尔米与小麦粉质量比60:40、山楂粉添加量8%、糙米粉添加量8%。

2.3 正交试验结果

正交试验结果及直观分析见表5。从表5可知，影响综合评分的排序为A>B>C，即塔尔米粉添加量>山楂粉添加量>糙米粉添加量，正交实验的最佳组合为A2B3C3，即添加塔尔米粉60%、山楂粉10%、糙米粉10%。

方差分析结果见表6。由表6可知，塔尔米粉添加量对塔尔米饼干的综合评分影响显著（P<0.05），其中塔尔米粉添加量的影响最大，山楂粉添加量的影响其次，最后是糙米粉添加量，此结果与正交试验极差分析结果相同。

为验证正交结果的准确性，根据正交优化结果进行3组平行验证试验，得到塔尔米饼干的综合评分为73.33±6.24 分，实验结果重复性好，说明所选最优工艺条件合理。

2.4 塔尔米饼干抗氧化能力分析结果

由图3a可知，塔尔米饼干清除DPPH自由基能力与浓度呈剂量效应关系，普通饼干、塔尔米饼干与抗坏血酸VC的清除DPPH自由基的IC50值分别为367.77±7.11、2.22±0.12、0.48±0.06 mg/mL，塔尔米饼干的DPPH自由基清除率高于普通饼干，差异性显著（P<0.05），表明塔尔米饼干具有清除DPPH自由基的能力。

由图3b可知，塔尔米饼干清除ABTS+自由基能力与浓度呈剂量效应关系，普通饼干、塔尔米饼干以及抗坏血酸VC清除ABTS+自由基的IC50值分别为5.84±0.49、3.84±0.40、1.83±0.11 mg/mL，塔尔米饼干的ABTS+自由基率高于普通饼干，差异性显著（P<0.05），表明塔尔米饼干具有清除ABTS+自由基的能力。

由图3c可知，塔尔米饼干总抗氧化能力与呈剂量效应关系，在浓度为10 mg/mL时，普通饼干、塔尔米饼干、抗坏血酸VC的总抗氧化能力分别为0.22±0.02、0.74±0.02、0.85±0.03，塔尔米饼干总抗氧化能力高于普通饼干，差异性显著（P<0.05），说明塔尔米饼干具有一定的总还原能力。

综上表明，塔尔米饼干具有一定的抗氧化活性，这可能是由于山楂多酚二氯甲烷萃取物具有最强的DPPH自由基清除能力[31]以及塔尔米中的多糖具有一定的抗氧化活性[13]。

表 5 正交试验结果表Table 5 Results of orthogonal test

表 6 方差分析结果Table 6 Analysis of variance

2.5 塔尔米饼干对高糖诱导的果蝇II型糖尿病模型糖脂代谢的影响

由图4可知，模型组与正常组相比，总蛋白含量、甘油三脂含量增加，差异性极显著（P<0.01）；海藻糖含量增加，差异性显著，有统计学意义（P<0.05）。塔尔米饼干高剂量组与模型组相比，总蛋白含量、甘油三脂含量及海藻糖含量都有所降低，其中总蛋白含量和甘油三脂含量与模型组相比差异性极显著（P<0.01），海藻糖含量与模型组相比差异性显著（P<0.05）。塔尔米饼干低剂量组与模型组相比，总蛋白、甘油三脂及海藻糖含量都有所降低，其中总蛋白与甘油三脂含量与模型组相比差异性极显著（P<0.01），海藻糖含量与模型组相比差异性不显著。

图 3 塔尔米饼干抗氧化能力分析Fig.3 Antioxidant ability analysis of Ta-er-mi biscuits

图 4 塔尔米饼干对的果蝇模型糖脂代谢的影响Fig.4 Effect of Ta-er-mi biscuits on glucose metabolism in a Drosophila model

综上所述，塔尔米饼干对高糖诱导的果蝇II型糖尿病模型的总蛋白含量、甘油三脂含量以及海藻糖的含量都具有明显降低的作用，说明塔尔米饼干具有降糖的功效，这可能是由于塔尔米多糖[13]和山楂粉中的多酚乙酸乙酯萃取物[31]具有一定的降糖作用。

3 结论

本实验研究了原料细度对饼干的影响、确定了塔尔米饼干的最优配方，并考察了在此配方下得到饼干的抗氧化性及降糖作用。结果表明当原料细度为80目时，塔尔米饼干的质构特性和感官评价最优；塔尔米饼干的最优配方为：塔尔米粉60%、山楂粉10%、糙米粉10%，在此条件下测得的塔尔米饼干DPPH自由基清除率、ABTS+自由基清除率和总抗氧化能力均明显优于普通饼干，表明塔尔米饼干具有一定的抗氧化活性；果蝇实验表明塔尔米饼干对高糖诱导的果蝇II型糖尿病模型的总蛋白含量、甘油三脂含量及海藻糖的含量的都有明显降低的作用，其中高剂量组总蛋白含量和甘油三脂含量与模型组相比差异性极显著（P<0.01），海藻糖含量与模型组相比差异性显著（P<0.05），说明塔尔米饼干具有一定的降糖功效，而塔尔米饼干的降脂作用有待研究。

本研究不仅增加了饼干品种的多样性，也为塔尔米、山楂及糙米资源的开发利用提供了科学依据，同时为糖尿病患者的辅助治疗提供了一种新型的功能性食品，具有广泛的开发应用价值。